成人小鼠成纤维细胞对红细胞生成子细胞的直接线重编程
Summary
在这里, 我们提出了我们的协议, 产生诱导红血球祖细胞 (iep) 从小鼠成纤维细胞使用转录因子驱动的直接谱系重新编程 (dlr)。
Abstract
红质细胞的承诺和分化是通过激活由一组细胞命运决定和成熟因素协调而设计的限制血统的转录网络进行的。我们之前的目的是定义所需的最小因素集, 以指导红血球发展使用直接的血统重新编程成诱导红细胞出生前体 (iep)。我们表明, gata1、 tal1、 lmo2和c-myc (gtlm) 的过度表达可以迅速将小鼠和人的成纤维细胞直接转化为形态、表型等类似于真正红血球细胞的 iep。和基因表达。我们意愿 iep 将为研究红细胞生成和细胞命运调节提供一个宝贵的工具。在这里, 我们描述了通过转录因子驱动的直接谱系重新编程 (dlr) 将小鼠尾尖成纤维细胞转化为 iep 的逐步过程。在本例中, 我们对红细胞膜细胞进行重新编程, 这些小鼠在促红细胞生成素受体基因 (epor) 启动子的控制下表达黄色荧光蛋白 (yfp), 从而实现红细胞细胞的可视化命运感应后重新编程。按照这一协议, 成纤维细胞可以在五到八天内重新编程到 iep 中。
虽然这个过程仍然可以改进, 但我们表明, gtlm 介导的重新编程是一个快速而直接的过程, 产生具有真正红血球祖细胞和前体细胞特性的细胞。
Introduction
红血球 (rbc) 在所有脊椎动物中都是必不可少的, 占人体所有细胞1的84%。从胚胎到成人的生命, 我们的健康高度依赖于 rbc 稳态的精确调节。在整个成年期的整个发育过程中, 正在进行的成熟红细胞生成被称为促红细胞生成。红细胞生成学研究的一个主要挑战是定义主调节器, 协调红细胞的发展和原始和最终红细胞生成之间的转换。红血球祖细胞的直接谱系重编程为进一步了解红血球在体内的发育提供了一个机会。
直接谱系重新编程 (dlr), 也称为转分化, 是将一种细胞类型直接重新编程到另一种细胞类型的过程, 绕过多能和多能祖细胞阶段。到目前为止, 德国航空和航天公司已被用于生产多种细胞类型, 包括神经2、造血3、4、5、肝病6和肾病7、祖细胞.对于发育生物学家来说, dlr 已成为询问血统承诺和终端分化过程8,9的重要工具。德国航空和航天公司可以补充和部分取代体内研究, 以了解细胞在发育过程中的命运决定因素的机制。本文所述的 dlr 对红血球祖细胞重新编程的协议为红细胞生成的发育研究提供了一种免费的方法。
我们之前已经证明, 过度表达四因素鸡尾酒gta1、 tal1、 lmo2和c-myc (gtlm), 足以将小鼠和人的成纤维细胞直接重新编程为诱导红细胞祖细胞(iep)10. glm 重新编程的红血球细胞在形态、表型和基因表达方面与真正的原始红血球祖细胞非常相似。因此, 一旦确定红细胞生成, 一旦形成, 一旦形成, 一旦形成, 一旦成为红细胞, 一旦成熟到有核的红细胞, 就会成熟到细胞核性红血球。通过改变重新编程条件 (例如,重新编程因素中的点突变或添加其他因素), 人们可以了解这如何导致红血球发育和分化的变化。例如, 我们已经表明, 在 gtlm 鸡尾酒中添加klf1或myb会改变全球蛋白表达模式, 从主要是胚胎 (原始) 转变为主要是成体 (最终)。这一发现证实了使用 dlr 作为定义红细胞生成发育因子的工具的有效性。
在这里, 我们概述了从小鼠尾端成纤维细胞 (ttf) 生成 iep 的过程。在我们具有代表性的结果中, 我们对红血球谱系追踪小鼠 (epro-crer26-eyfp ) 的成纤维细胞进行了重新编程, 这些小鼠在所有细胞中表达了来自rosa26位点的黄色荧光蛋白 (eyfp)。表达了促红细胞生成素受体, 使红血球谱系的承诺容易可视化。利用该方法, yfp 阳性 (epor +) 细胞早在转导后五天就存在。因此, 该协议为体外红细胞祖细胞的生成提供了一种快速而稳健的技术。
Protocol
Representative Results
Discussion
四因素鸡尾酒gta1、 tal1、 lmo2和c-myc (gtlm)的过度表达足以将小鼠和人成纤维细胞直接重新编程到 iep10。重新编程的红血球细胞在形态、表型、基因表达和菌落形成能力方面与真正的红血球祖细胞非常相似。这一发现证实了使用直接重新编程作为定义造血发育因素的工具的理由。为了支持这种方?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢黄伊夫琳和格雷戈里·海德 (剑桥怀特黑德研究所, 剑桥, 马萨诸塞州) 克隆和哈维·洛迪什 (怀特黑德研究所) 提供了许多用于生成抗逆转录病毒图书馆的质粒。我们感谢 kavitha siva 和 sofie singbrant (隆德大学分子医学和基因治疗系)、göran karlsson 和 shamit soneji (隆德大学分子血液学系) 在描述 iep 生产方面发挥的作用。我们还要感谢朱利安·普莱西奥 (巴塞罗那生物医学研究园再生医学中心)、violeta rayon-estrada (纽约洛克菲勒大学)、carl walkley (圣文森特医学研究所和墨尔本大学圣文森特医院医学系、安赫尔·拉亚 (巴塞罗那加泰罗尼亚研究和高级研究所) 和维贾伊·桑卡兰 (麻省理工学院和哈佛大学, 剑桥) 为他们以前对这项工作的贡献。这项工作得到了 ragnar söderberg 基金会的支持 (至 j. f.);瑞典研究理事会 (至 j. f.);stiftelsen olle engkvist Byggmästare (至 j. f.);瑞典战略研究基金会 (至 j. f.);奥克·维伯格基金会 (至 j. f.);a 玛丽·居里融合补助金 (授予 j. f.)。
Materials
| DMEM without sodium pyruvate | GE Life Sciences | SH30022.01 | Culturing media for PhGP cells |
| DMEM with sodium pyruvate | GE Life Sciences | SH30243.01 | Culturing media for tail tip fibroblasts |
| StemSpan Serum Free Expansion Media (SFEM) | Stem Cell Technologies | 9650 | Reprogramming media |
| Fetal Bovine Serum HyClone | GE Life Sciences | SH30071.03HI | Growth factor |
| Penicillin/Streptomycin HyClone (100x) | Ge Life Sciences | SV30010 | Antiboiotic |
| Non-Essential Amino Acids (100x) | Thermo Fisher | 11140050 | SNL media is suppplemented with this |
| Trypsin HyClone (1x) | GE Life Sciences | SH30042.01 | Cell dissociation agent |
| Murine Stem Cell Factor (mSCF) | Peprotech | 250-03 | Added to reprogramming media |
| Recombinant Murine Il-3 | Peprotech | 213-13 | Added to reprogramming media |
| human recombinant erythropoietin (hrEPO) | Peprotech | 100-64 | Added to reprogramming media |
| Dexamethasone | Sigma | 50-02-2 | Added to reprogramming media |
| Gelatin from porcine skin | Sigma | 9000-70-8 | Dissovled in dH2O and used for coating plates. Ensure sterility before use. |
| Blasticidin S hydrochloride | Sigma | 3/9/3513 | Selection antibiotic. Affects both pro- and eukaryotic cells |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Ge Life Sciences | SH30850.03 | Used for washing steps |
| Polybrene | Merck | TR-1003-G | Infection / Transfection Reagent |
| FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | Transfection Reagent for PhGP cell line |
| Millex-GP Syringe Filter Unit 0.22 µm | Merck | SLGP033RS | Used for filtering virus supernatant |
| BD Emerald Hypodermic Syringe | Becton Dickinson | SKU: 307736 | Used for filtering virus supernatant |
| 100 mm Culture Dish | Corning | 430167 | Cell culture |
| 6-well plate | Falcon | 10799541 | Cell culture |
| Jeweler Forceps #5 | Sklar | 66-7642 | Used for handling small tail fragments |
| Sklarlite Iris Scissors | Sklar | 23-1149 | Used for cutting the tail into small pieces |
| Lineage Cell Depletion Kit, mouse | Miltenyi Biotec | 130-090-858 | For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures |
| CD117 MicroBeads, mouse | Miltenyi Biotec | 130-091-224 | For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures |
| PheonixGP cells | ATCC | CRL-3215 | retroviral packaging cell line |
| EcoPAC vector (pCL-Eco) | Novus Biologicals | NBP2-29540 | retroviral helper vector containing gag and pol genes |
| pMX-Gata1 | Cloned in-lab | ||
| pMX-Tal1 | Cloned in-lab | ||
| pMX-Lmo2 | Cloned in-lab | ||
| pMX-cMyc | Cloned in-lab | ||
| CellSens Standard 1.6 software | Cytospin analysis software |
References
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