Summary

Directo linaje reprogramación de fibroblastos de ratón adulto a progenitores eritroides

Published: December 14, 2018
doi:

Summary

Presentamos nuestro protocolo para producir inducida por progenitores eritroides (iEPs) de fibroblastos adultos ratón usando transcripción basada en el factor dirigen linaje reprogramación (DLR).

Abstract

Diferenciación y compromiso de la célula eritroide proceden a través de la activación de una red transcripcional restringida linaje orquestada por un grupo de destino de la célula determinar y factores de maduración. Nos propusimos previamente para definir el conjunto mínimo de factores necesarios para instruir el desarrollo de glóbulos rojos con linaje directo la reprogramación de fibroblastos en inducido progenitores/los precursores eritroides (iEPs). Hemos demostrado que la sobreexpresión de Gata1, Tal1, Lmo2y c-Myc (GTLM) pueden rápidamente convertir murinas y humanas fibroblastos directamente al iEPs que se asemejan a las células eritroides de bona fide en términos de morfología, fenotipo, y expresión génica. Pretendemos que el iEPs proporcionará una valiosa herramienta para estudiar la regulación sino la eritropoyesis y de la célula. Aquí describimos el proceso gradual de conversión de fibroblastos de ratón cola punta en iEPs mediante transcripción basada en el factor directo linaje reprogramación (DLR). En este ejemplo, realizamos la reprogramación de fibroblastos de ratones de seguimiento del linaje eritroide que expresan la proteína amarilla fluorescente (YFP) bajo el control del promotor del gene (EpoR) receptor eritropoyetina, lo que permite la visualización de células eritroides inducción de destino sobre la reprogramación. Siguiendo este protocolo, pueden ser reprogramados fibroblastos en iEPs dentro de cinco a ocho días.

Mientras que todavía pueden introducirse mejoras al proceso, mostramos que GTLM-mediada reprogramación es un proceso rápido y directo, produciendo células con propiedades de buena fe las células progenitoras y precursoras eritroides.

Introduction

Glóbulos rojos (gr) son esenciales en todos los vertebrados y conforman el 84% de todas las células del cuerpo humano1. De embrión a la vida adulta, nuestra salud es altamente dependiente de la exacta regulación de la homeostasis de la RBC. La continua producción de glóbulos rojos maduros en todo el desarrollo en la edad adulta se conoce como eritropoyesis. Un desafío importante en la investigación de la eritropoyesis es definir los principales reguladores que orquestan el desarrollo de la RBC y el interruptor entre eritropoyesis primitiva y definitiva. Reprogramación de linaje directo de progenitores eritroides presenta una oportunidad para entiendo eritroides desarrollo in vivo.

Linaje directo reprogramación (DLR), también conocido como transdiferenciación, es el proceso de reprogramación de un tipo de célula directamente a otro, evitando pluripotenciales y progenitoras multipotentes etapas. DLR hasta el momento se ha utilizado para producir numerosos tipos de células incluyendo nervios2, hematopoyética3,4,5, hepática6 y nefrótico7, las células progenitoras. Para los biólogos del desarrollo, DLR se ha convertido en una herramienta importante para interrogar aspectos de linaje compromiso y procesos de diferenciación terminal8,9. DLR puede complementar y reemplazar parcialmente en vivo estudios de mecanismos de comprensión del destino celular factores determinantes durante el desarrollo. El protocolo DLR para reprogramación de progenitores eritroides que se describe en este artículo proporciona el campo un método gratuito para estudios del desarrollo de la eritropoyesis.

Previamente hemos demostrado que la sobreexpresión de un cóctel de cuatro factores, GATA1, TAL1, LMO2 y c-MYC (GTLM), es suficiente para reprogramar fibroblastos murinos y humanos directamente a progenitores eritroides inducida (iEPs) 10. las células eritroides GTLM el reprogramado mucho se asemejan a bona fide primitivo eritroides progenitores en cuanto a morfología, fenotipo y gene expresión10. Así iEPs tienen una capacidad de proliferación limitada y madurar a eritrocitos nucleados similares a los producidos transitoriamente en el embrión antes del inicio de la eritropoyesis definitiva. Al hacer cambios en las condiciones de reprogramación (p. ej., mutaciones de punto en reprogramación factores o la adición de otros factores), uno puede entender cómo esto conduce a cambios en la diferenciación y desarrollo eritroide. Por ejemplo demostramos que además de Klf1 o Myb al cóctel GTLM cambia el patrón de expresión de la globina de predominantemente embrionario (primitivos) para principalmente adultos (definitivo). Este hallazgo corrobora la validez de la utilización de DLR como una herramienta para la definición de factores de desarrollo en la eritropoyesis.

Aquí, describimos el proceso de generar iEPs de fibroblastos de punta de cola de ratón (TTF). En nuestros resultados representativos, se realizó la reprogramación en fibroblastos de los ratones de seguimiento del linaje eritroide (Epor– Cre R26– eYFP) que expresan la proteína amarilla fluorescente (eYFP) desde el locus Rosa26 en todas las células que han expresado el receptor de eritropoyetina, lo que permite la fácil visualización del compromiso del linaje eritroide. Usando este método, YFP (EpoR +) las células positivas están presentes tan pronto como cinco días después de la transducción de señales. Este protocolo, por lo tanto, ofrece una técnica rápida y robusta para la generación de progenitores eritroides en vitro.

Protocol

1. establecimiento y mantenimiento de cola de ratón primaria punta culturas del fibroblasto Preparar platos de cubierta de gelatina (se recomienda un plato de 10 cm para una cola) que cubre la superficie con 0.1% gelatina e incubando los platos para unos 20 min a 37 ° C. Aspire la solución de gelatina del plato y deje que se seque durante al menos 2 h. Eutanasia a los ratones por dislocación cervical. Quitar la cola con las tijeras, corte en la base de la cola. Poner la cola en suero salino de Dul…

Representative Results

Aquí presentamos un protocolo reproducible para la producción de iEPs de fibroblastos adultos usando transcripción factor-driven DLR. Evaluamos la reprogramación celular mediante citometría de flujo, formando Colonia ensayos y gen análisis de expresión. Para ayudar en la visualización de la conversión a destino de la célula eritroide, realizamos la reprogramación en fibroblastos de los ratones de seguimiento del linaje eritroide (Epor- Cre R26- eYFP) que expre…

Discussion

La sobreexpresión de un cóctel de cuatro factores, GATA1, TAL1, LMO2 y c-MYC (GTLM), es suficiente para reprogramar fibroblastos murinos y humanos directamente a iEPs10. Las células eritroides reprogramado mucho se asemejó a bona fide eritroides progenitores en cuanto a morfología, fenotipo, genes y capacidad formadora de colonias. Este hallazgo corrobora el fundamento de la utili…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a Evelyn Wang y Gregory Hyde (Whitehead Institute, Cambridge, MA) para clonación y Harvey Lodish (Whitehead Institute) para proporcionar muchos de la plásmidos utilizada para generar la biblioteca retroviral. Agradecemos a Kavitha Siva y Sofie Singbrant (Departamento de Medicina Molecular y genética Therapy, Universidad de Lund), Göran Karlsson y Shamit Soneji (Departamento de Hematología Molecular, Universidad de Lund) para sus funciones en la descripción de la iEP. También nos gustaría reconocer y agradecer a Julian Pulecio (centro de medicina regenerativa, Parque de investigación biomédica de Barcelona), Violeta rayón-Estrada (The Rockefeller University, New York), Carl Walkley (Instituto de investigación médica de San Vicente y Departamento de medicina, Hospital de San Vicente, Universidad de Melbourne), Ángel Raya (institución catalana de investigación y estudios avanzados, Barcelona) y Vijay G. Sankaran (Instituto Broad del Instituto Massachusetts de tecnología y de Harvard, Cambridge ) por sus contribuciones anteriores a este trabajo. Este trabajo fue financiado por la Fundación de Söderberg Ragnar (a j); el sueco de investigación Consejo (J.F.); Stiftelsen Olle Engkvist Byggmästare (a j); la Fundación sueca para la investigación estratégica (a j); Fundación de Åke Wiberg (J.F.); una beca de integración de Marie Curie (a J.F.).

Materials

DMEM without sodium pyruvate GE Life Sciences SH30022.01 Culturing media for PhGP cells
DMEM with sodium pyruvate GE Life Sciences SH30243.01 Culturing media for tail tip fibroblasts
StemSpan Serum Free Expansion Media (SFEM) Stem Cell Technologies 9650 Reprogramming media 
Fetal Bovine Serum HyClone GE Life Sciences SH30071.03HI Growth factor
Penicillin/Streptomycin HyClone (100x) Ge Life Sciences SV30010 Antiboiotic
Non-Essential Amino Acids (100x) Thermo Fisher 11140050 SNL media is suppplemented with this
Trypsin HyClone (1x) GE Life Sciences SH30042.01 Cell dissociation agent
Murine Stem Cell Factor (mSCF) Peprotech 250-03 Added to reprogramming media
Recombinant Murine Il-3 Peprotech 213-13 Added to reprogramming media
human recombinant erythropoietin (hrEPO) Peprotech 100-64 Added to reprogramming media
Dexamethasone Sigma 50-02-2   Added to reprogramming media
Gelatin from porcine skin Sigma 9000-70-8  Dissovled in dH2O and used for coating plates. Ensure sterility before use.
Blasticidin S hydrochloride Sigma 3/9/3513 Selection antibiotic. Affects both pro- and eukaryotic cells
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) Ge Life Sciences SH30850.03 Used for washing steps
Polybrene Merck TR-1003-G Infection / Transfection  Reagent
FuGENE HD Transfection Reagent Promega E2311 Transfection Reagent for PhGP cell line
Millex-GP Syringe Filter Unit 0.22 µm Merck SLGP033RS Used for filtering virus supernatant
BD Emerald Hypodermic Syringe Becton Dickinson SKU: 307736 Used for filtering virus supernatant
100 mm Culture Dish Corning 430167 Cell culture
6-well plate Falcon 10799541 Cell culture
Jeweler Forceps #5 Sklar 66-7642 Used for handling small tail fragments
Sklarlite Iris Scissors Sklar 23-1149 Used for cutting the tail into small pieces
Lineage Cell Depletion Kit, mouse Miltenyi Biotec 130-090-858 For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures
CD117 MicroBeads, mouse Miltenyi Biotec 130-091-224 For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures
PheonixGP cells ATCC CRL-3215 retroviral packaging cell line
EcoPAC vector (pCL-Eco)  Novus Biologicals NBP2-29540 retroviral helper vector containing gag and pol genes
pMX-Gata1 Cloned in-lab
pMX-Tal1 Cloned in-lab
pMX-Lmo2 Cloned in-lab
pMX-cMyc Cloned in-lab
CellSens Standard 1.6 software  Cytospin analysis software

References

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Citer Cet Article
Ilsley, M., Capellera-Garcia, S., Dhulipala, K., Johansson, A., Flygare, J. Direct Lineage Reprogramming of Adult Mouse Fibroblast to Erythroid Progenitors. J. Vis. Exp. (142), e58464, doi:10.3791/58464 (2018).

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