Diretto lignaggio riprogrammazione di fibroblasti di topo adulto ai progenitori eritroidi
Summary
Qui vi presentiamo il nostro protocollo per produzione indotta da progenitori eritroidi (iEPs) dai fibroblasti adulti del mouse utilizzando la trascrizione factor-driven diretto lignaggio riprogrammazione (DLR).
Abstract
Differenziazione e impegno delle cellule eritroidi procedere attraverso l’attivazione di una rete di transcriptional lignaggio-limitata orchestrata da un gruppo di destino delle cellule determinazione e fattori di maturazione. Abbiamo precisato in precedenza per definire il set minimo dei fattori necessari per istruire il globulo rosso sviluppo utilizzando discendenza diretta riprogrammazione dei fibroblasti in progenitori/precursori eritroidi indotta (iEPs). Abbiamo mostrato che la sovraespressione di Gata1, Tal1, Lmo2e c-Myc (GTLM) può rapidamente convertire murine ed umane fibroblasti direttamente a iEPs che assomigliano alle cellule eritroidi bona fide in termini di morfologia, fenotipo, e l’espressione genica. Intendiamo che iEPs fornirà uno strumento prezioso per studiare il regolamento di destino delle cellule e di eritropoiesi. Qui descriviamo il processo graduale di conversione fibroblasti punta coda murino in iEPs tramite trascrizione factor-driven discendenza diretta riprogrammazione (DLR). In questo esempio, eseguiamo la riprogrammazione in fibroblasti dai topi di lignaggio traccia degli eritrociti che esprimono la proteina fluorescente gialla (YFP) sotto il controllo del promotore del gene (EpoR) del recettore dell’eritropoietina, consentendo la visualizzazione di cellule eritroidi induzione di destino su riprogrammazione. A seguito di questo protocollo, fibroblasti possono essere riprogrammati in iEPs entro cinque-otto giorni.
Mentre possono ancora essere apportati miglioramenti al processo, indichiamo che GTLM-mediata riprogrammazione è un processo rapido e diretto, producendo cellule con proprietà di bona fide cellule eritroidi progenitrici e precursore.
Introduction
Globuli rossi (RBCs) sono essenziali in tutti i vertebrati e costituiscono l’84% di tutte le cellule dei corpi umani1. Da embrionali alla vita adulta, la nostra salute dipende altamente esatta regolazione dell’omeostasi di RBC. La produzione costante di RBCs maturo nel corso dello sviluppo in età adulta è noto come eritropoiesi. Una sfida importante nella ricerca di eritropoiesi è quello di definire i regolatori matrici che orchestrano sviluppo di RBC e lo switch tra eritropoiesi primitivo e definitiva. Discendenza diretta riprogrammazione dei progenitori eritroidi rappresenta un’opportunità per capire meglio degli eritrociti sviluppo in vivo.
Discendenza diretta riprogrammazione (DLR), noto anche come transdifferenziazione, è il processo di riprogrammazione di un tipo delle cellule direttamente in un altro, bypassando pluripotenti e fasi di progenitrici multipotenti. DLR finora è stato utilizzato per la produzione di numerosi tipi cellulari inclusi neurali2, ematopoietico3,4,5, epatica6 e nefrotica7, cellule progenitrici. Per i biologi dello sviluppo, DLR è diventato uno strumento importante per inquisitorie aspetti dell’impegno di lignaggio e differenziazione terminale processi8,9. DLR possono integrare e sostituire parzialmente in vivo studi per comprendere i meccanismi del destino delle cellule durante lo sviluppo i fattori determinanti. Il protocollo DLR per la riprogrammazione di progenitori eritroidi descritti in questo documento fornisce il campo un metodo gratuito per studi evolutivi dell’eritropoiesi.
Precedentemente abbiamo dimostrato che la sovraespressione di un cocktail di quattro-fattore, GATA1, TAL1, LMO2 e c-MYC (GTLM), è sufficiente per riprogrammare i fibroblasti sia murini ed umani direttamente ai progenitori eritroidi indotta (iEPs) 10. cellule eritroidi riprogrammato il GTLM assomigliano notevolmente bona fide degli eritrociti primitivi progenitori in termini di morfologia, fenotipo e gene espressione10. Così iEPs hanno una limitata capacità di proliferazione e matura in eritrociti nucleati simili a quelle prodotte transitoriamente nell’embrione precoce prima dell’inizio della eritropoiesi definitivo. Apportando modifiche nelle condizioni riprogrammazione (per esempio, mutazioni puntiformi nella riprogrammazione fattori o aggiunta di altri fattori), si può capire come questo comporti cambiamenti nello sviluppo degli eritrociti e differenziamento. Ad esempio abbiamo indicato che aggiunta di Klf1 o Myb al cocktail GTLM cambia il modello di espressione della globina da prevalentemente embrionale (primitivo) per principalmente per adulti (definitivo). Questa individuazione conferma la validità dell’utilizzo di DLR come strumento per la definizione dei fattori dello sviluppo nella eritropoiesi.
Qui, descriviamo il processo di generazione iEPs da fibroblasti di topo coda punta (TTF). Nei nostri risultati rappresentativi, abbiamo effettuato la riprogrammazione sui fibroblasti dai topi lignaggio traccia degli eritrociti (Epor– Cre R26– eYFP) che esprimono la proteina fluorescente gialla (eYFP) dal locus Rosa26 in tutte le cellule che hanno espresso il recettore dell’eritropoietina, permettendo facile visualizzazione di impegno per la stirpe degli eritrociti. Utilizzando questo metodo, YFP positivo (EpoR +) cellule sono presenti già cinque giorni dopo la trasduzione. Questo protocollo, pertanto, offre una tecnica veloce e affidabile per la generazione di progenitori eritroidi in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sovraespressione di un cocktail di quattro-fattore, GATA1, TAL1, LMO2 e c-MYC (GTLM), è sufficiente per la riprogrammazione di fibroblasti murini ed umani direttamente a iEPs10. Cellule eritroidi riprogrammate notevolmente ha assomigliato a bona fide progenitori eritroidi in termini di morfologia, fenotipo, espressione genica e possibilità di formazione di colonie. Questa scoperta co…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Evelyn Wang e Gregory Hyde (Whitehead Institute, Cambridge, MA) per la clonazione e Harvey Lodish (Whitehead Institute) per fornire molti dei plasmidi utilizzati per generare la libreria retrovirale. Ringraziamo Riccardo Siva e Sofie Singbrant (dipartimento di medicina molecolare e Gene Therapy, Università di Lund), Göran Karlsson e Shamit Soneji (dipartimento di ematologia molecolare, Università di Lund) per i loro ruoli nella descrizione della produzione iEP. Inoltre vorremmo citare e ringraziare Julian Pulecio (centro di medicina rigenerativa, Barcelona Biomedical Research Park), Violeta Rayon-Estrada (The Rockefeller University, New York), Carl Walkley (Istituto di ricerca medica di St. Vincent e Dipartimento di medicina, ospedale di St Vincent, Università di Melbourne), Ángel Raya (Istituto Catalano per la ricerca e studi avanzati, Barcellona) e Vijay G. Sankaran (Broad Institute del Massachusetts Institute of Technology e Harvard, Cambridge ) per i loro contributi precedenti a questo lavoro. Questo lavoro è stato supportato dalla Fondazione Söderberg Ragnar (di J.F.); la svedese di ricerca Consiglio (di J.F.); Stiftelsen Olle Engkvist Byggmästare (di J.F.); la Fondazione svedese per la ricerca strategica (a J.F.); Fondazione di Åke Wiberg (di J.F.); una borsa Marie Curie di integrazione (di J.F.).
Materials
| DMEM without sodium pyruvate | GE Life Sciences | SH30022.01 | Culturing media for PhGP cells |
| DMEM with sodium pyruvate | GE Life Sciences | SH30243.01 | Culturing media for tail tip fibroblasts |
| StemSpan Serum Free Expansion Media (SFEM) | Stem Cell Technologies | 9650 | Reprogramming media |
| Fetal Bovine Serum HyClone | GE Life Sciences | SH30071.03HI | Growth factor |
| Penicillin/Streptomycin HyClone (100x) | Ge Life Sciences | SV30010 | Antiboiotic |
| Non-Essential Amino Acids (100x) | Thermo Fisher | 11140050 | SNL media is suppplemented with this |
| Trypsin HyClone (1x) | GE Life Sciences | SH30042.01 | Cell dissociation agent |
| Murine Stem Cell Factor (mSCF) | Peprotech | 250-03 | Added to reprogramming media |
| Recombinant Murine Il-3 | Peprotech | 213-13 | Added to reprogramming media |
| human recombinant erythropoietin (hrEPO) | Peprotech | 100-64 | Added to reprogramming media |
| Dexamethasone | Sigma | 50-02-2 | Added to reprogramming media |
| Gelatin from porcine skin | Sigma | 9000-70-8 | Dissovled in dH2O and used for coating plates. Ensure sterility before use. |
| Blasticidin S hydrochloride | Sigma | 3/9/3513 | Selection antibiotic. Affects both pro- and eukaryotic cells |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Ge Life Sciences | SH30850.03 | Used for washing steps |
| Polybrene | Merck | TR-1003-G | Infection / Transfection Reagent |
| FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | Transfection Reagent for PhGP cell line |
| Millex-GP Syringe Filter Unit 0.22 µm | Merck | SLGP033RS | Used for filtering virus supernatant |
| BD Emerald Hypodermic Syringe | Becton Dickinson | SKU: 307736 | Used for filtering virus supernatant |
| 100 mm Culture Dish | Corning | 430167 | Cell culture |
| 6-well plate | Falcon | 10799541 | Cell culture |
| Jeweler Forceps #5 | Sklar | 66-7642 | Used for handling small tail fragments |
| Sklarlite Iris Scissors | Sklar | 23-1149 | Used for cutting the tail into small pieces |
| Lineage Cell Depletion Kit, mouse | Miltenyi Biotec | 130-090-858 | For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures |
| CD117 MicroBeads, mouse | Miltenyi Biotec | 130-091-224 | For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures |
| PheonixGP cells | ATCC | CRL-3215 | retroviral packaging cell line |
| EcoPAC vector (pCL-Eco) | Novus Biologicals | NBP2-29540 | retroviral helper vector containing gag and pol genes |
| pMX-Gata1 | Cloned in-lab | ||
| pMX-Tal1 | Cloned in-lab | ||
| pMX-Lmo2 | Cloned in-lab | ||
| pMX-cMyc | Cloned in-lab | ||
| CellSens Standard 1.6 software | Cytospin analysis software |
References
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