마우스 배아 줄기 세포 사용 하 여 남부 럽 연쇄 반응에서에서 동종 재결합 이벤트의 식별
Summary
여기, 우리 남부 럽 그리고/또한 PCR를 사용 하 여 마우스 배아 줄기 세포에서 발생 하는 동종 재결합 이벤트를 식별 하는 데 자세한 프로토콜 제시. 이 메서드는 nonmuscle myosin II 유전자 대체 마우스 모델 기술을 사용 하 여 전통적인 배아 줄기 세포 기반 동종 재결합 중재 대상의 세대에 의해 exemplified입니다.
Abstract
오프 대상 효과의 문제 및 디자이너 nucleases 게놈 편집, 배아 줄기에 대 한 응용 프로그램에서 긴 DNA 파편을 삽입의 어려움에 상대 (ES) 세포 기반 유전자를 대상으로 이러한 결점 없는 기술과 널리 큰 삭제/삽입에서 단일 염기 치환에 이르기까지 동물/마우스 게놈을 수정 하는 데 사용. 특히, 상대적으로 적은 동종 재결합 (HR) 이벤트를 얻기 위해 필요한 식별 원하는 ES 클론은 정확 하 고 안정적인 방법 요구 중요 한 단계. 남부 럽 또는 기존의 PCR 수시로이 목적을 위해 활용 됩니다. 여기, 우리는 그 두 가지 방법을 사용 하 여 마우스 ES 세포는 생 Myh9 유전자는 중단 하 고 다른 nonmuscle myosin 무 겁 사슬 IIs (NMHC IIs) 인코딩 cDNAs에 의해 대체 하기 위한 것에서 발생 하는 시간 이벤트를 식별 하는 자세한 절차를 설명 합니다. 남부 럽의 모든 절차는 vector(s), electroporation, 약물 선택, 확장 및 ES 세포/클론, 준비, 소화, 저장을 지정 하 고 게놈 DNA (gDNA)는 교 잡의 럽의 건설을 포함 하 고 probe(s), 및 x-선 필름에 autoradiography에의 마지막 단계 세척. PCR는 준비 하 고 희석 gDNA를 직접 수행할 수 있습니다. 이상적인 결과 얻기 위해 프로브 및 (재) 남부 럽에 대 한 절단 사이트 및 PCR 위한 뇌관 제한 효소 수 신중 하 게 계획 합니다. 비록 남부 럽의 실행 시간과 노동 집약적 이며 PCR 결과 판정, 남부 럽 및 PCR에 의해 신속한 검사 하 여 올바른 식별 설명 하는 이러한 방법을 단독 또는 결합 된 응용 프로그램 허용 널리 사용 하 고 대부분의 실험실 genotypes ES 세포 및 유전자의 식별에 의해 상담이 종이에서 동물 수정.
Introduction
기술 murine ES 세포에서 시간에 의해 대상으로 하는 유전자의 특정 유전자 변이1,2의 셀룰러 결과 해 부를 위한 강력한 도구를 제공 합니다. 중요성 및이 기술의 중요성 2007 노벨상 생리학 또는 약3,4;에 의해 그것의 인식에 반영 됩니다. 한편, 그것은 유전자 공학5의 현대 시대의 출현을 나타냅니다. 진 HR을 통해 대상 포인트 돌연변이에서 ES 세포6,7마우스의 게놈에 있는 큰 염색체 재배열에 이르기까지 거의 모든 변화를 활용할 수 있습니다. 그것은 잘 알려진 소위 게놈 편집 도구의 출현 하기 전에, 유전자 녹아웃 마우스의 세대 ES 세포8,9,10에 유전자를 대상으로 한 기술의 응용 프로그램 필요. 지난 2 년 동안 5000 개 이상의 유전자 타겟팅 마우스 모델링 인간의 질병 이나 유전자 기능11공부에 대 한이 접근 방식에 의해 생산 되었다. 유전자를 대상으로 벡터, 타겟된 ES 세포 클론, 및 사회 과학2,12,,1314 라이브 마우스를 배포 하기 위한 게놈 넓은 녹아웃 노력 설립 되었습니다. , 15. 의심할 여 지 없이, 셀 기반 HR 중재 유전자를 대상으로 기술에 크게 생리 적 또는 병 적인 맥락에서 유전자의 기능에 대 한 우리의 이해 고급.
HR은 포유류에는 상대적으로 드문 이벤트16,17, 중요 한 세포 및 다음 다음 단계 때문에 수많은 ES 식민지에서 발생 하는 돌연변이와 몇 클론을 식별을 위해 분석 하는 murine ES 세포에 유전자를 대상으로 대상 벡터18로 시간입니다. 시간 이벤트를 식별 하는 데 금 방법 등 남부 럽 PCR19,20. 접근의 이점 등는 남부 럽 올바르게 타겟된 ES 클론을 식별할 수 있는 유전자 타겟 이벤트 구문, 단일 복사본 삽입의 검증 등의 구조를 분석 하는 연구를 허용 하면서는 PCR 기반 전략 HR 이벤트21,22에 대 한 더 빠른 심사를 허용합니다. 하지만 이러한 방법은 단점, 같은 그들은 소모와 잘못 된 반응, 그들의 조합 사용은 널리 허용 하 고 가질 수 시간 이벤트 식별에 대부분의 실험실에 의해 적용, ES 세포에서 특정 유전자 생성에 대 한 수정 동물입니다.
포유류에서 각각의 3 개의 다른 유전자 (명명 된 Myh9, Myh10, 및 Myh14) 및 경 쇄의 두 쌍으로 인코딩됩니다 두 동일한 NMHC IIs 구성 된 nonmuscle myosin II (NM II)의 3 개의 isoforms II-A, ⅱ B, 및 II C23을 이라고 합니다. 이전 연구는 적어도 표시는 배아 치24,,2526이 isoforms의 비보에 절제 하기 때문에 II A 및 II B의 isoforms 마우스 개발에 대 한 필수적입니다. 이 문제를 회피 하 고 마우스 개발, 유전자 보충의 나중 단계에서 II A 및 II B의 isoform 특정 기능에 대 한 새로운 통찰력을 얻을 셀 기반 HR 중재 하는 유전자를 대상으로 기술 ES를 사용 하 여 전략을 채택 마우스 모델27의 일련을 생성 합니다. 원하는 ES 클론 식별, 동안 남부 럽 및 PCR 방법을 이용 하였다, 그리고 이러한 입증 효율적이 고 신뢰할 수 있는27,28.
이 종이 남부 럽 고 PCR, vector(s), probe(s), 및 뇌관, 및 실험의 실행 뿐만 아니라 시간 이벤트 식별 exemplified 결과의 분석 대상의 디자인을 포함 하 여에 대 한 자세한 설명을 제공 하고자 모델 및 대표 데이터 유전 교체 NM II 마우스를 만들기 위한 ES 세포에 발생. 여기에 제시 된 이러한 두 메서드의 프로토콜 식별 유전자 변형된 세포 또는 동물의 genotypes 또한 채택 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
현재, 게놈 편집 디자이너 nucleases 여전히 ES 세포 기반 유전자를 대상으로 기술 대상에서 효과 및 긴 DNA 조각30,31삽입에 어려움의 그것의 문제로 바꿀 수 없습니다. 메서드로 골든 마우스 ES 세포에서 발생 하는 시간 이벤트를 식별 하는 데,이 보고서는 필드에 대 한 남부 럽 고 PCR의 상세한 프로토콜을 제공 합니다. 우리는 일련의 구문 대상으로 마우스 ES…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품의 국가 자연과학 기초의 중국 (보조금 번호 31571432), 인간의 지방 자연 과학 재단의 중국 (보조금 번호 2015JC3097), 그리고는 연구 재단의 교육 국의 호남 일반 프로그램에서 지원 받은 (보조금 번호 15 K 054) 지방, 중국.
Materials
| BAC CLONE | BACPAC Resources Center (BPRC) | bMQ-330E21 | |
| QIAGEN Large-Construct Kit | QIAGEN | 12462 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27104 | |
| QIAGEN Plasmid Plus Maxi Kit | QIAGEN | 12963 | |
| PfuUltra High-Fidelity DNA Polymerase | Agilent | 600382 | |
| T-easy vector | Promega | A1360 | |
| Nuclei Lysis Solution | Promega | A7941 | |
| Protein Precipitation Solution | Promega | A7951 | |
| DNA Denaturing Solution | VWR | 351-013-131 | |
| DNA Neutralizing Solution | VWR | 351-014-131 | |
| Ready-To-Go DNA Labeling Beads (-dCTP) | VWR | 27-9240-01 | |
| UltraPure SSC, 20X | Thermo Fisher | 15557036 | |
| UltraPur Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v) | Thermo Fisher | 15593031 | |
| G418 | Thermo Fisher | 10131035 | |
| Salmon Sperm DNA Solution | Thermo Fisher | 15632011 | |
| Platinu Taq DNA Polymerase High Fidelity | Thermo Fisher | 11304029 | |
| Not I | Thermo Scientific | ER0592 | |
| Dra I | Thermo Scientific | ER0221 | |
| EcoR I | Thermo Scientific | ER0271 | |
| Ganciclovir | Sigma | G2536 | |
| Whatman TurboBlotter Transfer System, Large Kits | Fisher Scientific | 09-301-188 | |
| [α32P]dCTP | PerkinElmer | NEG013H100UC | |
| ProbeQuan G-50 Micro Columns | GE Healthcare | 28-9034-08 | |
| Hybrisol I Hybridization Solution | Millipore | S4040 | |
| Kodak X-Ray Film | Z&Z Medical | 844 5702 |
References
- Gao, G., McMahon, C., Chen, J., Rong, Y. A powerful method combining homologous recombination and site-specific recombination for targeted mutagenesis in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (37), 13999-14004 (2008).
- Skarnes, W., et al. A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function. Nature. 474 (7351), 337-342 (2011).
- Vogel, G. Nobel Prizes. A knockout award in medicine. Science. 318 (5848), 178-179 (2007).
- Salsman, J., Dellaire, G. Precision genome editing in the CRISPR era. Biochemistry. Cell Biology. 95 (2), 187-201 (2017).
- Capecchi, M. Gene targeting in mice: functional analysis of the mammalian genome for the twenty-first century. Nature Reviews Genetics. 6 (6), 507-512 (2005).
- Van, d. W. L., Adams, D. J., Bradley, A. Tools for targeted manipulation of the mouse genome. Physiological Genomics. 11 (3), 133-164 (2002).
- Glaser, S., Anastassiadis, K., Stewart, A. F. Current issues in mouse genome engineering. Nature Genetics. 37 (11), 1187 (2005).
- Bradley, A., Evans, M., Kaufman, M. H., Robertson, E. Formation of germ-line chimaeras from embryo-derived teratocarcinoma cell lines. Nature. 309 (5965), 255-256 (1984).
- Robertson, E., Bradley, A., Kuehn, M., Evans, M. Germ-line transmission of genes introduced into cultured pluripotential cells by retroviral vector. Nature. 323 (6087), 445-448 (1986).
- Thomas, K. R., Capecchi, M. R. Site-directed mutagenesis by gene targeting in mouse embryo-derived stem cells. Cell. 51 (3), 503-512 (1987).
- Skarnes, W. C., et al. A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function. Nature. 474 (7351), 337 (2011).
- Collins, F. S., Rossant, J., Wurst, W. A mouse for all reasons. Cell. 128 (1), 9-13 (2007).
- Poueymirou, W. T., et al. F0 generation mice fully derived from gene-targeted embryonic stem cells allowing immediate phenotypic analyses. Nature Biotechnology. 25 (1), 91-99 (2007).
- Pettitt, S. J., et al. Agouti C57BL/6N embryonic stem cells for mouse genetic resources. Nature Methods. 6 (7), 493-495 (2009).
- Gertsenstein, M., et al. Efficient Generation of Germ Line Transmitting Chimeras from C57BL/6N ES Cells by Aggregation with Outbred Host Embryos. PLoS One. 5 (6), 11260 (2012).
- Smithies, O., Gregg, R. G., Boggs, S. S., Koralewski, M. A., Kucherlapati, R. S. Insertion of DNA sequences into the human chromosomal |[beta]|-globin locus by homologous recombination. Nature. 317 (6034), 230-234 (1985).
- Deng, C., Capecchi, M. R. Reexamination of gene targeting frequency as a function of the extent of homology between the targeting vector and the target locus. Molecular & Cellular Biology. 12 (8), 3365 (1992).
- Lay, J. M., Friishansen, L., Gillespie, P. J., Samuelson, L. C. Rapid confirmation of gene targeting in embryonic stem cells using two long-range PCR techniques. Transgenic Research. 7 (2), 135-140 (1998).
- Langerak, P., Nygren, A. O. H., Schouten, J. P., Jacobs, H. Rapid and quantitative detection of homologous and non-homologous recombination events using three oligonucleotide MLPA. Nucleic Acids Research. 33 (22), 188 (2005).
- Gómezrodríguez, J., et al. Advantages of q-PCR as a method of screening for gene targeting in mammalian cells using conventional and whole BAC-based constructs. Nucleic Acids Research. 36 (18), 117 (2008).
- Kim, H. S., Smithies, O. Recombinant fragment assay for gene targeting based on the polymerase chain reaction. Nucleic Acids Research. 16 (18), 8887-8903 (1988).
- Joyner, A. L., Skarnes, W. C., Rossant, J. Production of a mutation in mouse En-2 gene by homologous recombination in embryonic stem cells. Nature. 338 (6211), 153-156 (1989).
- Ma, X., Adelstein, R. S. The role of vertebrate nonmuscle Myosin II in development and human disease. Bioarchitecture. 4 (3), 88-102 (2014).
- Malonek, D. Relationships between the dynamics of cortical blood flow, oxygenation, and volume changes following sensory stimulation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, (1997).
- Takeda, K., Kishi, H., Ma, X., Yu, Z. X., Adelstein, R. S. Ablation and mutation of nonmuscle myosin heavy chain II-B results in a defect in cardiac myocyte cytokinesis. Circulation Research. 93 (4), 330-337 (2003).
- Conti, M. A., Evenram, S., Liu, C., Yamada, K. M., Adelstein, R. S. Defects in cell adhesion and the visceral endoderm following ablation of nonmuscle myosin heavy chain II-A in mice. Journal of Biological Chemistry. 279 (40), 41263-41266 (2004).
- Wang, A., et al. Nonmuscle myosin II isoform and domain specificity during early mouse development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (33), 14645-14650 (2010).
- Zhang, Y., et al. Mouse models of MYH9-related disease: mutations in nonmuscle myosin II-A. Blood. 119 (1), 238 (2012).
- Liu, T., et al. Identification and characterization of MYH9 locus for high efficient gene knock-in and stable expression in mouse embryonic stem cells. PLoS One. 13 (2), 0192641 (2018).
- Saito, S., Adachi, N. Advances in the Development of Gene-Targeting Vectors to Increase the Efficiency of Genetic Modification. Biological & Pharmaceutical Bulletin. 39 (1), 25-32 (2016).
- Langerak, P., Nygren, A., Schouten, J., Jacobs, H. Rapid and quantitative detection of homologous and non-homologous recombination events using three oligonucleotide MLPA. Nucleic Acids Research. 33 (22), 188 (2005).
- Martin, S. L., et al. A single amino acid substitution in ORF1 dramatically decreases L1 retrotransposition and provides insight into nucleic acid chaperone activity. Nucleic Acids Research. 36 (18), 5845-5854 (2008).
- Kamisugi, Y., Cuming, A. C., Cove, D. J. Parameters determining the efficiency of gene targeting in the moss Physcomitrella patens. Nucleic Acids Research. 33 (19), 173 (2005).
- Luo, Y., Bolund, L., Sørensen, C. B. Pig gene knockout by rAAV-mediated homologous recombination: comparison of BRCA1 gene knockout efficiency in Yucatan and Göttingen fibroblasts with slightly different target sequences. Transgenic Research. 21 (3), 671-676 (2012).
- Croning, M. D., Fricker, D. G., Komiyama, N. H., Grant, S. G. Automated design of genomic Southern blot probes. BMC Genomics. 11 (1), 74 (2010).
- Zimmer, A., Gruss, P. Production of chimaeric mice containing embryonic stem (ES) cells carrying a homoeobox Hox 1.1 allele mutated by homologous recombination. Nature. 338 (6211), 150-153 (1989).
