Summary
ここでは、脊髄スライス培養における膠 (SG) ニューロンから作られた全細胞パッチク録音のために不可欠な手順について述べる。このメソッドでは、組み込みの膜特性、シナプス伝達、調査される SG ニューロンの形態的特性をことができます。
Abstract
膠 (SG) ニューロンからの最近の全細胞パッチク ランプ-研究は、膨大な感覚伝達、侵害受容規制と慢性的な痛みやかゆみの開発の基礎となる脊髄のメカニズムについての情報を提供しています。急性脊髄スライスの効用に基づく形態学的研究と電気生理学的記録の実装は、神経膜特性の理解と SG の局所回路の構成にさらに改善しています。脊髄スライスとショー代表全細胞記録の形態の調製のための詳しく、実用的なガイドを紹介します。このプロトコルは、理想的な神経の保存を許可し、生体内である程度条件を模倣することができます。要約すると、脊髄スライス培養準備を取得できる安定した電流、電圧クランプ録音を有効にしたがって局所神経回路の組み込み膜プロパティに詳細な調査を促進する可能性があり、様々 な実験的アプローチによる神経の構造。
Introduction
膠 (SG、ラミナの脊髄後角 II) は送信および感覚情報を規制する議論の余地なく重要な中継センターです。一次求心性線維、ローカル介在ニューロンと内因性下行抑制系1から入力を受ける興奮性と抑制性の介在ニューロン、それで構成されます。最近十年間の急性脊髄スライス標本の開発と全細胞パッチク ランプ記録の出現 SG ニューロン2,の本質的な電気生理学的および形態学的特性の様々 な研究が可能にします。3,SG5,6の局所神経回路の研究と同様、 4 。また、体外脊髄スライス標本を使用して、研究者は、神経 excitabilities7,8の変化を解釈できる、9,10チャンネルはイオンの機能と各種病態下でシナプス活動11,12 。これらの研究は深めた SG ニューロンが開発に果たす役割の理解や慢性的な痛みや神経因性のかゆみのメンテナンスです。
基本的に、神経相馬や急性脊髄スライスを使用して理想的な全細胞パッチ適用の明確に可視化を達成するために重要な前提条件は、健康とパッチ適用可能な細胞を得ることができるので、スライスの優れた品質を確保するためです。しかし、脊髄スライスの準備と、腹側椎弓切除術を実行する、健康的なスライスの取得の障害となるクモ膜膜の削除など、いくつかの手順が含まれます。脊髄スライスを準備するは簡単じゃないがいくつかの利点があります脊髄スライス上の in vitro録音を実行します。細胞培養の準備と比較して、脊髄スライス部分的に関連する生理学的条件は、固有のシナプス接続を保持できます。さらに、脊髄スライスを使用して録音全細胞パッチクは二重パッチ クランプ13,14、形態学的研究15,16シングルセル RT-PCR 法などの他の手法と組み合わせることができます。17します。 したがって、この手法は、特定地域内で解剖学的および遺伝的多様性の特性に関する詳細と局所神経回路の構成の調査では。
ここでは、急性脊髄スライスの準備及び SG ニューロンから全体セル ホールセル記録手法の基本と詳細な説明を提供します。
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Protocol
説明すべての実験のプロトコルは、動物倫理委員会の南昌大学 (南昌、PR 中国、倫理 No.2017-010) によって承認されました。すべての努力は、実験動物の苦痛やストレスを最小限に抑えるため行われました。ここで実行される電気生理学的記録は、常温 (RT、22-25 ° C) を実施しました。
1. 動物
- どちらの性別の Sprague-dawley ラット (3-5 週齢) を使用します。12 時間の明暗周期下動物の家し、十分な食糧や水に自由にアクセスします。
2. ソリューションおよび材料の準備
- ソリューション
- (MM) における人工髄液 (アプライド) を準備: 3.6 117 塩化ナトリウム、KCl、1.2 NaH2PO4·2H2O、2.5 CaCl2·2H2O、1.2 MgCl2·6H2O、25 NaHCO3、11 D グルコース、0.4 アスコルビン酸 2ピルビン酸ナトリウム。表 1を参照してください。
- (MM) のショ糖アプライドの準備: 240 ショ糖、2.5 KCl、1.25 NaH2PO4·2H2O、0.5 CaCl2·2H2O、3.5 MgCl2·6H2O、25 NaHCO3、0.4 のアスコルビン酸、ピルビン酸 2 ナトリウム。表 2を参照してください。
- K+を準備-ベース (mM) の細胞内のソリューション: グルコン酸 K 130-5 KCl、10 Na2-0.5 グリコールエーテルジアミン四酢酸、10 HEPES はクレアチンリン酸 4 Mg ATP と 0.3 李 GTP。表 3を参照してください。
- Cs+を準備-ベース (mM) の細胞内のソリューション: 92 CsMeSO4、43 CsCl 10 Na2-クレアチンリン酸、5 テトラエチル アンモニウム (茶) - Cl、0.5 グリコールエーテルジアミン四酢酸、10 HEPES、4 Mg - ATP と 0.3 李 GTP。表 4を参照してください。
注: すべてのソリューションは、蒸留水を使用して準備する必要があります。アプライドとショ糖アプライド約 7.4 の最適な pH を維持するために使用する前に carbogenated (95% O2と 5% CO2の混合物) をする必要があります、これらの 2 つの溶液の浸透圧は 300-310 mOsm に調整必要があります。アスコルビン酸は、カルシウム チャネルに影響を与えることができるので 1 つはカルシウム電流を記録したい場合このエージェントを省略する必要があります。浸透圧と細胞内の溶液の pH を測定し、それぞれ 290 – 300 mOsm と 7.2-7.3 に調整ください。0.2 μ m フィルターで細胞内のソリューションをフィルター処理し、-20 ° C で 1 mL 因数としてソリューションを格納お勧めCs+と紅茶の Cs+適用-ベースのアンプを使用して潜在的な膜を保持するために助長されているブロック カリウム チャネルに細胞内ソリューション 0 で安定した mV 抑制性シナプス電流 (Ips) を記録するとき。 - 0.05% neurobiotin 488 ソリューションを準備します。K+の neurobiotin 4 で 488 mL の 2 mg を溶解-ベースの細胞内のソリューションと、蒸留水またはサッカロースを使用して必要な場合、290 – 300 mOsm に浸透圧を調整します。
メモ: ショ糖の 1 mM は 1 mOsm で浸透圧を増加します。 - ブロックとして脊髄の 3% 寒天培地を準備します。ガラス ビーカーに精製水 250 mL の寒天の 7.5 g を溶解し、沸騰するまで加熱し、オフに電子レンジを使用します。ソリューションを旋回、17.5 cm × 10.5 cm × 1.8 cm 凝固後のプラスチックの箱に混合物を注ぐ。使用前に 4 ° C で寒天をしてください。
- 4% パラホルムアルデヒド (PFA) を免疫組織化学的処理に備えます。ミックス 40 g 〜 800 mL に PFA 粉体の加熱 (約 60 ° C) PBS ソリューション (130 mM NaCl、Na2HPO4、7 mM 3 mM NaH2PO4) x 1。ゆっくりと PFA パウダーが完全に溶けるまで 1 N 水酸化ナトリウム滴を追加することで、pH を調整します。解決策は明らかになった、一度 1x PBS で 1 L に容量を調整します。7.2-7.4 1 N の hcl 4 %pfa ソリューションをフィルター処理し、使用するまで-20 ° C で保管して、必要なときに pH を調整してください。
注: PFA は有毒、マスク、手袋、保護メガネを着用する必要があるのでです。4% を準備するプロセスを行う換気フード内部 PFA。粉体 PFA は、pH 約 9-10 で完全に溶解することができます。
-
楽器
- 典型的な電気生理学的システム、赤外線微分干渉コントラスト (IR DIC) と高解像度水の液浸対物レンズ、CCD/CMOS カメラ、パッチ ・ クランプ アンプ、ピペット ホルダーを搭載した直立した顕微鏡を使用し、マニピュレーター ピペット位置の細かい調整が可能です。XY ステージも顕微鏡を移動する必要です。
- ファラデーケージに囲まれた振動アイソレーション テーブル上のすべての機器をマウントします。神経細胞を観察し、マイクロ ピペットを視覚化するビデオカメラにビデオ モニターを接続します。
-
マイクロ ピペット
- ホウケイ酸ガラス管をマイクロ ピペットの引き手を使用してから記録電極を作る。典型的なピペット抵抗の範囲は、3-6 MΩ ときに細胞内液でいっぱいです。
-
寒天ブロック
- 1.2 cm × 1.5 cm × 2.0 cm 寒天ブロックを準備します。必要に応じて、図 1に示す形にブロックをトリムします。
3. 急性脊髄スライス標本
注: 横断または傍脊髄スライス説明18,19,20以前として調理されます。
- Transcardial 血流と脊髄抽出前、~ 500 mL スクロース-アプライド 95% O2と 5% CO2平衡を準備し、クール冷たいへの解決策 (0-4 ° C)。
- 氷の上のすべての郭清のツールは (例えばはさみ、アイリスはさみ、歯の鉗子、微細鉗子、カーブタイプ鉗子を解剖) を冷やします。急性脊髄スライスの準備の図を図 1に示します。
- Transcardial 血流
- ウレタン (1.5 g/kg) の単一の注入 (腹腔内、i. p.) 後、2-3 分待つし、つま先や尾のピンチの応答をテストすることによってラットの麻酔深度を評価します。麻酔外科平面を維持すると、一度は、仰臥位で砕いた氷にラットを配置します。
注: 開胸の中に深い麻酔痛み感十分の生産、あなたのローカル IACUC のガイドラインに従ってください。 - 鎖骨、剣状突起から皮膚を切開 (3-4 cm) を確認し、剣状突起の下に横切開を行います。
- 把握し、横隔膜を完全に公開するカーブタイプ鉗子のペアで剣状突起を発生させます。通しダイアフラム、横切開し、胸骨と肋骨胸の空洞を開くには二国間の間胸部を切り取ります。胸郭を固定すると、心臓は十分に公開されているので、剣状突起を把握するのにカーブタイプ鉗子を使用します。
- 別のカーブタイプ鉗子で優しく、心を保持し、大動脈弓のベースに左心室を通して 22 G 針を挿入します。
- すぐに高級ハサミで右房をカットし、冷たい、酸素ショ糖アプライド重力システムを介しての灌流を開始します。
注: 冷たいショ糖アプライドで迅速かつ十分な transcardial 血流低ナトリウムとカルシウム濃度が興奮性毒性を緩和し、神経機能を守るために役立つかもしれないが、脊髄の急速な冷却を促進できます。さらに、赤色の血液細胞をクリア形態学的研究を実行するときに、背景の染色 biocytin の削減のために有益でしょう。灌流は右心房を出る流体はラットの肝臓と足の色が淡い、明確な限り十分なと満足するいると見なされます。22 G 針の先端は心臓や大動脈の破裂を避けるために鈍である必要があります。
- ウレタン (1.5 g/kg) の単一の注入 (腹腔内、i. p.) 後、2-3 分待つし、つま先や尾のピンチの応答をテストすることによってラットの麻酔深度を評価します。麻酔外科平面を維持すると、一度は、仰臥位で砕いた氷にラットを配置します。
- 脊髄の解剖とスライス
- 灌流の状態で両側胸部の背骨と肋骨の間を切って、吻側に尾から背中肌に縦切開 (5 cm) を確認します。
- 背骨の尾側端でカットをする、はさみを使用して、周囲の組織を切り取る、脊椎の腰仙部セグメントを急速に分離します。
- 腰仙部のセグメントを冷たいショ糖ベース アプライドを含んでいるガラス皿に転送します。腹側を上向き、左右相称椎骨の椎弓根を切って、脊髄を慎重に公開する高級はさみを使用します。2 cm 長い脊髄腰仙部拡大 (L1-S3) とを分離し、脊髄のセクションを満ちている冷たいショ糖アプライド別ガラス皿に転送します。
- 髄膜と解剖顕微鏡の下でクモ膜膜を削除します。できるだけ早く離れてすべての腹と背根をカットします。
- 以前トリミング寒天ブロックに脊髄を配置します。横スライスを準備するには、脊髄の腹側を付ける、寒天、ブレードに向かう背側します。傍矢状洞スライスを準備、図 1に示すように、瞬間接着剤で腹側を垂直方向の寒天に取り付けます。その後、瞬間接着剤と vibratome のプラットフォームに寒天のブロックをマウントします。300-500 μ m の横または 0.025 mm/s と 80 Hz の振動の送り速度と傍矢状洞スライスを準備します。
- プラスチック トリムのピペットを使用すると、記録する前に、少なくとも 30 分のための 32 ° C で継続的に酸素のアプライドを含む貯蔵室でナイロン メッシュの上にスライスを転送します。
注: 削除するとき脳膜と脊髄根特に背側角、脊髄への損傷を避けるために注意してください。脊髄は背腹スライスする必要があります。最良の結果を急速に (15-20 分) 以内のスライスが準備されるべき。脊髄スライスの厚さは、細胞可視性を満たすためにこれ以上より 600 μ m をする必要があります。さらに、上記の方法を利用して水平脊髄スライスが取得される可能性があります。
4. 細胞のホールセルパッチク ランプ記録
- SG ニューロンから全体セル ホールセルパッチク ランプ記録を実施する K+を使用して、-Cs+を適用している間ほとんどの録音の場合、細胞内のソリューションをベース-ベースの抑制性シナプス電流の記録だけにソリューション。
- 優しく記録室に脊髄スライスを移動し、それ U 字白金細線を最適なスライスの安定のためにしっかりとナイロン スレッドに接続を維持します。着実に重力システムによって RT でバブルのアプライドでスライスを灌流し、十分な酸素化を達成するために 2-4 mL/分で灌流率を設定します。
- 低解像度顕微鏡レンズを使用して SG (半透明バンド) の領域を識別する、ターゲット セルとして高解像度の目的を使用して、健康的なニューロンを選択、ビデオ モニター画面の中央にそれを調整します。
- K+の適切なボリュームでピペットを埋める-基づくまたは Cs+-電極ホルダーにマイクロ ピペットを挿入し、細胞内のソリューション内銀線に連絡していることを確認、必要に応じて、細胞内のソリューションをベース、ホルダーです。
- 焦点にマイクロ ピペットをもたらすと、マニュピュレーターを使用してアプライドに没頭し、穏やかな肯定的な圧力 (~ 1 psi 圧力計で測定した場合) に適用任意の汚れや破片からピペットを強制します。
- 対象となるニューロンに向けてマイクロ ピペットを徐々 に移動します。ピペット、gigaseal を形成する神経細胞の膜にニューロンおよび非常に小さいディンプル フォームに近づく一度肯定的な圧力をリリースします。
- -70 に潜在的な保有物の変更は、生理学的に近い膜電位を休んで (RMP) セルの mV。膜を破裂し、良い全体セル構成を作成するマイクロ ピペットに過渡的で穏やかな吸引を適用します。
メモ: スライスを記録室に編入、スライス表面上の破片をクリアする、少なくとも 5 分の安定した血流を確保します。それは、健康と不健康な/デッド ニューロン間を区別する能力が良いシーリングと安定した記録の最も重要は注目に値するです。不健康な/デッド ニューロンいます腫れ、または縮められた外観、目に見える大きな核と共に健康的なニューロンは、明るいと滑らかな膜を 3 次元 (3 D) の形状によって特徴付けられる、その核は表示されません。全体セル構成を達成するためには、必要な場合に段階的な高速または低容量を補うために不可欠です。常温では、液絡部の潜在的な計算、15.1-15.2 mV と k+4.3-4.4 mV-ベースと Cs+-細胞内のソリューションをそれぞれベースします。私たちの研究では、記録されたデータが液間電位の修正されません。 - 本質的な膜特性の録音
- 本質的な膜特性を記録: 直ちにレコード RMP (20 内 s) で休憩後。電流クランプ モードで RMP で脱分極電流を電圧応答 (10 pA、500 ms) を測定することによって神経の入力抵抗を決定します。
- 発火特性記録: 1 のシリーズで電流クランプの各ニューロンの発火パターンをテスト脱分極電流パルス (25-150 pA 25 pA の増分で) RMP で s。しきい値、振幅およびオフラインに単一活動電位の半分幅を測定します。
- サブスレッショルド電流を記録: 不定サブスレッショルド電流を評価するために開催膜電位-50 mV 電圧クランプ モードで。-60 から 1 時間の電圧パルス過分のシリーズを適用して-120 mV mV、10 mV デクリメントします。
- 興奮性シナプス電流 (工) を記録: k+レコード工-ベースの-70 の開催可能性でクランプ電圧モードで細胞内ソリューション mV。
- レコード Ips: 適用 Cs+-ベースの Ips を記録するため細胞内のソリューション。全体セル構成が確立されると、膜電位で保持-70 mV、0 に潜在的な保有物を変更し 〜 5 分 mV 徐々 に。安定化は、数分待ってから、IPSC のイベントを記録するために開始します。
注:-50 mV と表示のオーバー シュートでは未満、RMP の唯一のニューロンはさらなる研究のため選択する必要があります。本研究ではシリーズ抵抗は 10-30 MΩ では通常、直列抵抗が 20% 以上変更記録を除外すべき。工は 50 μ m APV 風呂アプリケーションで確認できると 20 μ M CNQX、10 μ M ビククリンにより 1 μ M ストリキニーネと Ips を確認可能性があります。
5. 形態学的研究
- 形態実験用 K+-0.05% neurobiotin 488 を含む細胞内の溶液を用いた。
- 少なくとも 20 分記録電気生理学的安定を維持し後、ゆっくりと再シールし、脊髄スライスを 4% を入れた容器に転送する細胞膜を許可するように上向き方向にマイクロ ピペットを削除 PFA。4% で、スライスを修正する PFA 常温 1 時間放置、4 ° C 一晩。
- Pbs は、スライスをすすいで、その後 30 分間 50% エタノールに浸ってください。PBS で洗浄 3 つの別の後、メディアをマウントをスライド上に、元の厚さのスライスをマウントします。
- 共焦点顕微鏡を使用 (材料表参照) 画像の獲得および神経細胞の 3次元再構成のため。1.5 μ m の z スタック 20 X レンズを通してニューロンをスキャンします。
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Representative Results
急性脊髄スライスは、図 1に示す図に従って調製しました。スライスと回復後、脊髄スライスは、記録室に移されました。健康的なニューロンは、IR DIC 顕微鏡を用いた相馬外観に基づいて識別されました。次に、SG ニューロンの活動電位が脱分極電流パルス (1 時間) のシリーズによって誘発されるときのニューロンは、RMP で開催されました。に示すよう図 2、発火パターン SG ニューロンが含まれている強壮剤焼成、遅延発火で観察されたギャップ焼成初期バースト、一過性破裂、単一スパイク、消極的焼成前の調査によって分類や記載されています。
この準備を実装すると、我々 にも記録サブスレッショルド電流と自発的に現われる電流電圧クランプ。サブスレッショルド電流、電流の過分極反応活性化の代表的な痕跡 (私h)、T 型カルシウム電流 (IT) と A 型カリウム電流 (IA)図 3 aで与えられています。これらの流れは-50 で細胞を保持することによって得られた mV と徐々 にステップ 10 mV デクリメントで-60 から-120 mV。私hが過分極電圧ステップによって有効化されました。ただし、私はTと私のいた脱分極電圧と続いて不活性化から解放するプリパルス過分極がアクティブに。図 3B3 cは代表自然工 (sEPSCs) と Ips (sIPSCs) それぞれ SG ニューロンから記録を示しています。振幅とこれらのシナプス イベントの頻度は、ミニ解析ソフトウェアを使用してオフライン分析でした。
神経細胞の形態学的特徴を特徴付ける、SG ニューロンのほとんど持っているので大幅樹状ツリーの rostrocaudal 広がり、neurobiotin 488 が細胞内のソリューションに追加された傍矢状洞スライスが適用されました。神経相馬と範囲のサイズと樹状突起の寸法は、共焦点顕微鏡イメージング後に評価しました。以前に報告、SG ニューロン形態の区別を表示、中央セル、放射状の細胞、垂直のセル、膵島細胞および芽細胞に分類することができます。これらの細胞の代表的な顕微鏡写真を図 4に示します。
図 1: 急性脊髄スライス標本のダイアグラム。ウレタン (i. p.) と麻酔が深く、ラットが transcardially 冷たい carbogenated スクロース アプライドで灌流です。脊柱の解剖は迅速にし、そして腹側椎弓切除術を行った。髄膜・ クモ膜膜及び添付の脊髄神経根が削除されます。その後、脊髄標本は、アガロース ブロックにマウントされます。傍矢状洞や横スライスは、必要に応じて、vibratome とカットされます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: SG のニューロンの発火パターン。発射パターンは、一連 1 の注入によって決まります s RMP で SG 細胞に脱分極電流パルス。強壮剤焼成、遅延発火、ギャップ焼成、初期バースト、一過性破裂、単一スパイクと消極的発火発火パターンが分類されるかもしれません。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: SG ニューロン電圧クランプ録音します。(A) 代表的なトレース過分極電流注入として分類されるへの応答を示すh、私は私はT。下のパネルは、電圧クランプのサブスレッショルド電流を想起させるプロトコルを示しています。(B) sEPSCs の代表的な痕跡が-70 で SG ニューロンから記録不在そして 50 μ M APV の存在の mV と 20 μ M CNQX。(左) 前に拡大の時間スケールに表示される連続した痕跡を下げ、グラフ記録以下に示すバーで示される期間に対応する APV の CNQX、アクション (右) の下で。(C) sIPSCs の代表的な痕跡が不在そして 10 の μ M ビククリンにより、0 で 1 μ M ストリキニーネの存在の SG ニューロンから記録された mV。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: ラット SG ニューロンの代表的な形態です。相馬サイズと共焦点顕微鏡画像に示す樹状突起のプロパティによると SG 細胞は中央細胞 (A)、放射状の細胞 (B)、垂直セル (C)、膵島細胞 (D) および未分類セル (Eとして分類されるかもしれない).V: 腹;D: 背;R: 吻側;C: 尾。スケールバー = 50 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| コンポーネント | 分子の重量 | 濃度 (mM) | グラム/L |
| 塩化ナトリウム | 58.5 | 117 | 6.84 |
| KCl | 74.5 | 3.6 | 0.27 |
| NaH2PO4·2H2O | 156 | 1.2 | 0.19 |
| CaCl2·2H2O | 147 | 2.5 | 0.37 |
| MgCl2·6H2O | 203 | 1.2 | 0.24 |
| NaHCO3 | 84 | 25 | 2.1 |
| D-グルコース | 180 | 11 | 1.98 |
| アスコルビン酸 | 198.11 | 0.4 | 0.08 |
| ピルビン酸ナトリウム | 110 | 2 | 0.22 |
表 1: アプライドのレシピ。
| コンポーネント | 分子の重量 | 濃度 (mM) | グラム/L |
| 塩化ナトリウム | 58.5 | 117 | 6.84 |
| KCl | 74.5 | 3.6 | 0.27 |
| NaH2PO4·2H2O | 156 | 1.2 | 0.19 |
| CaCl2·2H2O | 147 | 2.5 | 0.37 |
| MgCl2·6H2O | 203 | 1.2 | 0.24 |
| NaHCO3 | 84 | 25 | 2.1 |
| D-グルコース | 180 | 11 | 1.98 |
| アスコルビン酸 | 198.11 | 0.4 | 0.08 |
| ピルビン酸ナトリウム | 110 | 2 | 0.22 |
表 2: ショ糖アプライドのレシピ。
| コンポーネント | 分子の重量 | 濃度 (mM) | mg/100 mL |
| K グルコン酸 | 234.2 | 130 | 3044.6 |
| KCl | 74.5 | 5 | 37.28 |
| ナ2-クレアチンリン酸 | 453.38 | 10 | 453.38 |
| グリコールエーテルジアミン四酢酸 | 380.35 | 0.5 | 19.02 |
| HEPES | 238.31 | 10 | 238.3 |
| Mg ATP | 507.18 | 4 | 202.9 |
| 李 GTP | 523.18 | 0.3 | 15.7 |
表 3: K+のレシピ-ベースの細胞内のソリューション。
| コンポーネント | 分子の重量 | 濃度 (mM) | mg/100 mL |
| CsMeSO4 | 228 | 92 | 2097.6 |
| CsCl | 168.36 | 43 | 723.95 |
| ナ2-クレアチンリン酸 | 453.38 | 10 | 453.38 |
| 紅茶 Cl | 165.71 | 5 | 82.86 |
| グリコールエーテルジアミン四酢酸 | 380.35 | 0.5 | 19.02 |
| HEPES | 238.31 | 10 | 238.3 |
| Mg ATP | 507.18 | 4 | 202.9 |
| 李 GTP | 523.18 | 0.3 | 15.7 |
表 4: Cs+のレシピ-ベースの細胞内のソリューション。
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Discussion
このプロトコルの詳細 SG ニューロン18,19,20,21の全細胞パッチク ランプ-実験を行う際、我々 は正常に使用している脊髄スライスを準備するための手順。このメソッドを実装すると、我々 は最近報告ミノサイクリン、テトラサイクリンの第二世代は著しく19SG ニューロンのシナプス メカニズムを介して抑制性シナプス伝達を高めることができます。さらに、このエージェントがh私の振幅を減少でき、さらに21SG ニューロンの興奮性を抑制します。これらを支援する公開データと我々 表示ここでは、現在この方法は電気生理学的研究の広い範囲での使用に適した代表的な結果。
前述のとおり、transcardial 潅流は健康的な試料を得るための重要な要素です。脊髄を急速に冷却することができ、神経細胞の代謝低下22をすることができますので、まず、我々 は灌流の冷たいソリューションを使用します。ショ糖代わりに 2 番目、アプライド、低 Na+濃度 '保護切断' ソリューションはパッシブの+ Na 流入を改善するでき、したがって水エントリ23を介して神経の浮腫を減少させます。第三に、取得し、灌流 biocytin22によって引き起こされる背景を抑えることができるので神経の形態を分析に有益です。成功の準備のため、神経保存24を可能にする酸化的損傷を減らすためにいくつかの抗酸化物質を使用することが重要ですも。したがって、我々 のプロトコルで我々 は補足アスコルビン酸やピルビン酸ナトリウム、強力な抗酸化物質を効果的に、アプライドでショ糖アプライド脊髄スライスで浮腫を改善できます。また、我々 の経験で私たちから入手できます健康的な脊髄スライス正常に 3-10 週間、新生児古い SD ラット。したがって、このプロトコル成功するには、10 週齢未満は、SD ラットを用いたをお勧めします。
患者と切断、ストレッチまたは脊髄の分割を避けるために注意してください、'腹' 椎弓切除術を行うと脳膜と脊髄神経、1 つを削除する必要があります。いくつかの研究で添付後根が脊髄スライスは、シナプスを評価する使用されている伝送 SG ニューロンは末梢25,26を受信しました。クモ膜の膜を削除する手順は、この場合は、技術的な難しさは、多くの忍耐力が必要です。
手法の準備もこのスライスには、いくつかの制限があります。1 つの明確な欠点は急性スライスは、豊富なシナプス接続を維持、それがないの本当の状態を反映、正確に何が起こるの体内に対処します。いくつかの研究が生体内で実装しているため、通常は録画実行 'ブラインド'27,28,29。ただし、この体内アプローチは技術的に難しいと相馬または十分な経験のない樹状突起から録音を行うかどうかを指示することは困難です。私たちの現在のメソッドの別の制限は、そのショ糖アプライドできない可能性があります神経保存のための齧歯動物の老化からスライスを準備するときです。Na+の代替を提案されている、この最適化方法論は著しく急性スライス30,31 の神経細胞の形態や機能の保全を改善できると N-メチル-D-glucamine を使用して更新されたアプローチ ,32,33。最後に、SG ニューロンは、形態学的および電気生理学的特性の異なる3を表示します。不均一性を眺めながら全体セルの録音から得られたデータを解釈することは困難です。この制限はかわしたことがありますさらに検証の形態学的詳細記録ニューロン5または研究者を助けることができる遺伝子導入マウスを用いた識別特定ニューロン20,34。さらに、全細胞パッチ ・ クランプ記録の特定イオン チャネルまたは蛋白質の役割を研究し、特定の神経回路を調査と光遺伝学、細胞35, サブ人口の制御を可能にする新しいツールを組み合わせることができます。
全体的に、この手法はパッチク ランプ記録、免疫蛍光染色、特定の補完、SG のニューロンの電気生理学的、形態学的、薬理学的、生物学的特性を調査するための理想的な方法作動薬や拮抗薬、単一セル PCR 技術。また、ペアのホールセルパッチク ランプ記録またはオプトジェネティクス、と共にこのアプローチを適用することができます、つまり、神経回路を照らすための貴重なツール。
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Disclosures
著者は利益相反を宣言しません。
Acknowledgments
この作品は、中国の国家自然科学基金 (第 81560198、31660289) からの助成金によって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Sigma | S7653 | Used for the preparation of ACSF and PBS |
| KCl | Sigma | 60130 | Used for the preparation of ACSF, sucrose-ACSF, and K+-based intracellular solution |
| NaH2PO4·2H2O | Sigma | 71500 | Used for the preparation of ACSF, sucrose-ACSF and PBS |
| CaCl2·2H2O | Sigma | C5080 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
| MgCl2·6H2O | Sigma | M2670 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
| D-Glucose | Sigma | G7021 | Used for the preparation of ACSF |
| Ascorbic acid | Sigma | P5280 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
| Sodium pyruvate | Sigma | A7631 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
| Sucrose | Sigma | S7903 | Used for the preparation of sucrose-ACSF |
| K-gluconate | Wako | 169-11835 | Used for the preparation of K+-based intracellular solution |
| Na2-Phosphocreatine | Sigma | P1937 | Used for the preparation of intracellular solution |
| EGTA | Sigma | E3889 | Used for the preparation of intracellular solution |
| HEPES | Sigma | H4034 | Used for the preparation of intracellular solution |
| Mg-ATP | Sigma | A9187 | Used for the preparation of intracellular solution |
| Li-GTP | Sigma | G5884 | Used for the preparation of intracellular solution |
| CsMeSO4 | Sigma | C1426 | Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution |
| CsCl | Sigma | C3011 | Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution |
| TEA-Cl | Sigma | T2265 | Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution |
| Neurobiotin 488 | Vector | SP-1145 | 0.05% neurobiotin 488 could be used for morphological studies |
| Agar | Sigma | A7002 | 3% agar block was used in our protocol |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | 4% paraformaldehyde was used for immunohistochemical processing |
| Na2HPO4 | Hengxing Chemical Reagents | Used for the preparation of PBS | |
| Mount Coverslipping Medium | Polyscience | 18606 | |
| Urethan | National Institute for Food and Drug Control | 30191228 | 1.5 g/kg, i.p. |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | TW150F-4 | 1.5 mm OD, 1.12 mm ID |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | Used for the preparation of micropipettes |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| Vibration isolation table | Technical Manufacturing Corporation | 63544 | |
| Infrared CCD camera | Dage-MIT | IR-1000 | |
| Patch-clamp amplifier | HEKA | EPC-10 | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | MP-285 | |
| X-Y stage | Burleigh | GIBRALTAR X-Y | |
| Upright microscope | Olympus | BX51WI | |
| Osmometer | Advanced | FISKE 210 | |
| PH meter | Mettler Toledo | FE20 | |
| Confocol microscope | Zeiss | LSM 700 |
References
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