Summary
여기, 우리가 시험관에서 척수 조각에서 신경 세포 substantia gelatinosa (SG)에서 만든 전체 셀 패치 클램프 기록에 대 한 필수 단계 설명 합니다. 이 메서드는 기본 막 속성, 시 냅 스 전송 및 공부 SG 뉴런의 형태학 상 특성을 수 있습니다.
Abstract
신경 세포 substantia gelatinosa (SG)에서 최근 전체 셀 패치 클램프 연구는 큰 신체의 감각 전송, nociceptive 규정과 만성 통증이 나 가려움 개발 기본 척추 메커니즘에 대 한 정보를 제공 합니다. 신경 속성에 대 한 우리의 이해 및 sg에서 지역 회로의 구성에 추가 형태학 연구 급성 척수 조각의 유틸리티에 따라 함께 electrophysiological 녹음의 구현 향상 되었습니다. 여기, 우리는 척수 조각 및 쇼 대표 전체 세포 기록 및 형태학 결과의 준비에 대 한 상세 하 고 실용적인 가이드를 제시. 이 프로토콜 이상적인 신경 보존을 허용 하 고 어느 정도 조건 vivo에서 모방 수 있습니다. 요약 하자면, 척수 조각의 생체 외에서 준비 얻을 수 안정 된 전류와 전압 클램프 녹음을 가능 하 게 수 따라서 용이 하 내장 막 속성, 로컬 회로에 대 한 자세한 조사와 다양 한 실험 방법을 사용 하 여 신경 구조입니다.
Introduction
Substantia gelatinosa (SG, lamina 척추 등 경적의 II) 전송 하 고 규제 하는 감각 정보에 대 한 논의 여지가 없 중요 한 릴레이 센터 이다. 그것은 기본 구심 섬유, 지역 수 및 생 내림차순 억제 시스템1에서 입력을 받아 흥분 성의 억제 수 구성 됩니다. 최근 수십 년간, 급성 척수 조각 준비의 개발 및 전체 셀 패치 클램프 기록의 출현 설정한 SG 뉴런2, 의 본질적인 electrophysiological 및 형태학 속성에 대 한 다양 한 연구 3 , 4 뿐만 아니라 SG5,6에 로컬 회로의 연구. 또한, 생체 외에서 척수 조각 준비를 사용 하 여 연구원 신경 excitabilities7,8에 변화를 해석할 수 있는, 이온의 기능9,10, 채널 및 시 냅 스 활동11,12 다양 한 병 적인 조건 하에서. 이러한 연구 개발에 재생 SG 신경 역할에 대 한 우리의 이해 및 만성 통증과 neuropathic 가려움증의 유지 보수 깊 어 있다.
기본적으로, 이상적인 전체 셀 패치 급성 척수 조각을 사용 하 여 신경 소마의 명확한 시각화를 달성 하기 위해 핵심 필수 건강 하 고 패치되지 뉴런 얻어질 수 있다 조각의 우수한 품질을 보장 하기 위해입니다. 그러나, 척수 조각 준비 복 부 laminectomy 수행 하 고 건강 한 조각을 얻기에 장애물이 될 수 피아-거미 집 모양의 막 제거 등의 여러 단계가 포함 됩니다. 그것은 척수 조각 준비 하기 쉬운, 척수 조각에 녹음에서 시험관에서 수행는 여러 가지 장점이 있습니다. 셀 문화 준비에 비해, 척수 조각 순수 관련 조건에는 고유한 시 냅 스 연결을 부분적으로 보존할 수 있습니다. 또한, 전체 셀 패치 클램프 척수 조각을 사용 하 여 녹음 더블 패치 클램프13,14, 형태학 연구15,16 단일 셀 RT-PCR 등의 다른 방법을 결합 될 수 있는 17. 따라서,이 특정 지역 내에서 해 부와 유전 다양성을 특성화에 더 많은 정보를 제공 합니다 기술과 지역 회로의 구성의 조사에 대 한 수 있습니다.
여기, 우리는 급성 척수 조각을 준비 하 고 전체 셀 패치 클램프 기록 SG 뉴런에서 인수에 대 한 우리의 방법의 기본과 상세한 설명을 제공 합니다.
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Protocol
모든 실험 프로토콜 설명 동물 윤리 위원회의 남 창 대학 (난창, 홍보 중국, 윤리적인 No.2017-010)에 의해 승인 되었다. 모든 노력이 스트레스와 실험 동물의 고통을 최소화 하기 위해 만들어졌다. 여기 수행 electrophysiological 녹음 실 온 (RT, 22-25 ° C)에서 실행 되었다.
1입니다. 동물
- 어느 섹스의 Sprague-Dawley 쥐 (3-5 주 이전)을 사용 합니다. 12 h 빛 어두운 주기에서 동물을 집 고 그들에 게 충분 한 음식 및 물 광고 libitum 액세스.
2입니다. 솔루션 및 자료 준비
- 솔루션
- 준비 하는 인공 뇌 척추 액체 (실제) (mM): 117 NaCl, 3.6 KCl, 1.2 NaH2포4·2H2O, 2.5 CaCl2·2H2O, 1.2 MgCl2·6H2O, 25 NaHCO3, 11 D-포도 당, 0.4 ascorbic 산 및 2 나트륨 pyruvate입니다. 표 1을 참조 하십시오.
- 자당-실제 (mM)에서 준비: 240 자당, 2.5 KCl, 1.25 NaH2포4·2H2O, 0.5 CaCl2·2H2O, 3.5 MgCl2·6H2O, 25 NaHCO3, 0.4 Ascorbic 산 그리고 2 나트륨 pyruvate. 표 2를 참조 하십시오.
- K+준비-기반 (mM)에 세포내 솔루션: 130 K-구 루 콘, 5 KCl, 10 나2-phosphocreatine, 0.5 EGTA, 10 HEPES, 4 Mg-ATP, 그리고 0.3 Li-GTP. 표 3을 참조 하십시오.
- Cs+준비-기반 (mM)에 세포내 솔루션: 92 CsMeSO4, 43 CsCl, 10 나2-phosphocreatine, 5 tetraethylammonium (차)-Cl, 0.5 EGTA, 10 HEPES, 4 Mg-ATP, 그리고 0.3 Li-GTP. 표 4를 참조 하십시오.
참고: 모든 솔루션이 준비 되어야 한다 증류수를 사용 하 여. 실제 및 자당 실제 약 7.4의 최적의 pH를 유지 하기 위해 사용 하기 전에 carbogenated (95% O2 , 5% CO2 혼합물) 이어야 하며이 두 솔루션의 osmolality 300-310 mOsm을 조정 한다. 아 스 코르 빈 산 칼슘 채널에 영향을 미칠 수, 때문에이 에이전트 하나 칼슘 전류를 기록 하려는 경우 생략 해야 합니다. Osmolality 및 세포내 솔루션의 pH 측정와 각각 290-300 mOsm을 7.2-7.3 조정 있어야 합니다. 세포내 솔루션 0.2 µ m 필터 필터링-20 ° c.에 1 mL aliquots로 솔루션을 저장 하는 것이 좋습니다. Cs+ 및 차 Cs+에 적용 됩니다-기반 블록 칼륨 채널 사용 하 여 앰프는 막 잠재력에 도움이 되는 세포내 솔루션 0에서 꾸준한 mV 금지 postsynaptic 전류 (Ipsc)를 기록할 때. - 0.05% neurobiotin 488 솔루션을 준비 합니다. K+의 neurobiotin 488에서 4 mL의 2 밀리 그램을 분해-세포내 솔루션을 기반으로 하 고 필요한 경우 증류수 또는 자당을 사용 하 여 290-300 mOsm osmolality 조정.
참고: 자당의 1 m m 1 mOsm osmolarity를 증가합니다. - 척수에 대 한 블록으로 3 %agar 준비 합니다. 순화 된 물 유리 비 커에서 250 mL에 한 천의 7.5 g을 녹이 고 하 고 끓는 때까지 열 전자 레인지를 사용 하 여. 솔루션의 소용돌이는 17.5 c m x 10.5 c m x 1.8 cm 플라스틱 상자 응고 후에 혼합물을 부 어. 4 ° C에서는 한 계속 사용 하기 전에.
- Immunohistochemical 처리에 대 한 4 %paraformaldehyde (PFA)를 준비 합니다. ~ 800 ml의 PFA 가루 믹스 40 g (약 60 ° C)가 열 PBS 솔루션 (130 m m NaCl, 7 m m 나2HPO4, 3mm NaH2포4) x 1. 천천히 PFA 분말 완전히 해산 될 때까지 1 N NaOH 방울을 추가 하 여 pH를 조정 합니다. 솔루션 취소 되고있다, 일단 1 x PBS 가진 1 l 총 볼륨을 조정 합니다. PH 7.2-7.4 1 N HCl 필요할 때, 그리고 4 %PFA 솔루션 필터링 사용까지-20 ° C에서 그것을 저장을 사용 하 여를 재조정합니다
참고: PFA 이므로 독성, 마스크, 장갑 뿐만 아니라 안전 안경을 착용 하는 데 필요한. 4%를 준비 하는 과정을 수행 PFA 통풍된 후드 내부. PFA 분말 약 9-10의 pH에 완전히 해산 될 수 있다.
-
악기
- 전형적인 electrophysiological 시스템 사용 적외선 차동 간섭 콘트라스트 (IR-DIC)와 고해상도 물 침수 목표, CCD/CMOS 카메라, 패치 클램프 증폭기, micropipette 홀더 장착 된 수직 현미경 및 micromanipulator 피펫은 위치의 미세 조정 허용입니다. XY 스테이지 또한 현미경을 이동 하려면 필요 합니다.
- 패러데이 케이지로 둘러싸인 진동 절연 테이블에 모든 장비를 탑재 합니다. 신경 세포를 관찰 하 고 시각화는 micropipettes를 비디오 카메라에 비디오 모니터를 연결 합니다.
-
Micropipettes
- 기록 전극 micropipette 끌어당기는 사람을 사용 하 여 붕 규 산 유리 모 세관에서 확인 합니다. 3-6 m ω 세포내 솔루션으로 채워질 때 전형적인 피 펫 저항 범위.
-
한 블록
- 1.2 cm x 1.5 cm x 2.0 c m 한 블록을 준비 합니다. 필요에 따라 그림 1 에 표시 된 모양으로 블록을 잘라.
3. 급성 척수 슬라이스 준비
참고: 가로 또는 parasagittal 척수 조각 준비 이전 설명된18,,1920.
- Transcardial 관류 및 척수 추출, 이전 ~ 500 mL 자당-실제 equilibrated 95% O2 , 5% CO2 를 준비 하 고 얼음을 솔루션을 냉각 (0 ~ 4 ° C).
- 모든 해 부 도구 (예를 들어, 가 위, 아이리스가 위, 이빨된 집게, 집게를 잘, 곡선된 겸 자 해 부) 얼음에 식혀. 급성 척수 조각 준비의 다이어그램은 그림 1에 표시 됩니다.
- Transcardial 관류
- 우 레 탄 (1.5 g/kg)의 단일 주사 (복, i.p.), 후 2-3 분을 기다려야 하 고 발가락이 나 꼬리 핀치 응답을 테스트 하 여 쥐의 마 취 깊이 평가. 일단 마 취의 수술 평면 유지 부정사 위치에 얼음에 쥐를 놓습니다.
주: thoracotomy 동안 깊은 마 취 통증의 지 각에 대 한 충분 한 생산, 현지 IACUC 지침을 따릅니다. - 쇄 골, 칼 과정에서 피부를 통해 (3-4 cm) 절 개를 확인 하 고 칼 절차의 수준 아래 가로 절 개를 하 게.
- 파악 하 고 횡 경 막 완전히 노출 곡선된 집게의 쌍 칼 프로세스를 인상. 통해 횡 경 막, 횡 절 개를 만들고 가슴뼈와 갈비뼈 양측 흉 여 사이 흉 곽을 극복. 굽은 집게를 사용 하 여 흉 곽을 고정 하 고 심장 충분히 노출 칼 프로세스를 파악.
- 부드럽게, 다른 곡선된 겸 자 마음 잡고 하 고 좌 심 실 대동맥 아치의 자료를 통해 22 G 바늘을 삽입 합니다.
- 즉시, 오른쪽 아 트리 움 잘가 위로 잘라 고 얼음 처럼 차가운, 산소 자당-실제 중력 시스템을 통해 관류를 시작 합니다.
참고: 차가운 자당-실제와 신속 하 고 충분 한 transcardial 관류 낮은 나트륨 및 칼슘 농도 흥분 성의 독성을 완화 하 고 신경 기능을 보호 하기 위해 도움이 될 수 있지만, 척수의 급속 한 냉각 촉진 수 있습니다. 또한, 붉은 혈액 세포를 지우기 형태학 연구를 수행할 때 biocytin의 배경 얼룩을 줄이기 위한 도움이 될 것 이다. 관류 액체 종료 오른쪽 아 트리 움은 분명 하 고 쥐의 간, 발 색은 창백 충분 하 고 만족을 간주 됩니다. 22 G 바늘의 끝 무딘 심장 및 대동맥 아치 파열 방지 해야 합니다.
- 우 레 탄 (1.5 g/kg)의 단일 주사 (복, i.p.), 후 2-3 분을 기다려야 하 고 발가락이 나 꼬리 핀치 응답을 테스트 하 여 쥐의 마 취 깊이 평가. 일단 마 취의 수술 평면 유지 부정사 위치에 얼음에 쥐를 놓습니다.
- 척수의 해 부 및 슬라이스
- 뒤에서 피부 꼬리 rostral, 관류의 상태에서 어느 한쪽에 척추와 갈비뼈 사이 흉 곽을 통해 다음 컷에 세로 절 개 (5 cm)를 확인 합니다.
- 척추의 꼬리 끝에 컷을 확인 하 고가 위를 사용 하 여 주변 조직, 버려야 빠르게 lumbosacral 세그먼트는 척추의 분리.
- 얼음 처럼 차가운 자당 기반 실제를 포함 하는 유리 접시에 lumbosacral 세그먼트를 전송 합니다. 위쪽 복 부 쪽으로 좋은 위를 사용 하 여 양측 척추 작은 꽃 자루를 극복 하 고 척수를 신중 하 게 노출. 2 cm 긴 척추 코드 lumbosacral 확대 (L1-S3)를 분리 하 고 다른 유리 접시 가득 찬 자당-실제 척추 섹션을 전송.
- Meninges과 해 현미경 피아-거미 집 모양의 막 제거 합니다. 최대한 빨리 멀리 모든 복 부와 지 뿌리를 잘라.
- 이전 트림된 한 블록에 척수를 놓습니다. 가로 분할 영역을 준비 하는 agar를 척수의 복 부 측을 첨부 하 고 잎으로 등 쪽을 보자. 그림 1에서 보듯이 parasagittal 슬라이스를 준비 하려면 수직 방향으로 한 천 하 superglue와 복 부 측을 연결 합니다. 그런 다음 superglue와 vibratome의 플랫폼으로 한 블록을 탑재 합니다. 가로 300-500 µ m 또는 0.025 m m/s와 80 Hz의 진동 주파수의 사전 속도와 parasagittal 슬라이스를 준비 합니다.
- 플라스틱 트림 피 펫을 사용 하 여 지속적으로 산소 실제 녹음 전에 적어도 30 분 동안 32 ° C에를 포함 하는 저장 챔버에 나일론 메쉬에 슬라이스를 전송.
참고: meninges 척추 뿌리를 제거 하는 때 척수, 특히 등 쪽 뿔에 부상을 피하기 위해 주의. 척수 등 ventrally 슬라이스 한다. 최상의 결과 얻으려면 빠르게 (15-20 분) 내에서 슬라이스를 준비 한다. 척추 슬라이스의 두께 셀 가시성을 충족 하기 위해 더 이상 600 µ m 이어야 한다. 또한, 위에서 설명한 기술은 수평 척수 조각 얻을 사용 될 수 있습니다.
4. 전체 셀 패치 클램프 기록
- SG 뉴런에서 전체 셀 패치 클램프 녹화를 수행 하려면 K+-Cs+를 적용 하는 동안 대부분의 녹음 경우 세포내 솔루션을 기반으로-금지 postsynaptic 현재 녹음에만 솔루션을 기반으로.
- 부드럽게 척수 조각 녹음 실로 이동한 다음 U 자 모양의 백 금 철사와 함께 나일론 스레드 단단히 최적의 슬라이스 안정성에 대 한 연결을 유지 합니다. 꾸준히 중력 시스템을 통해 실시간에 버블링 된 실제와 슬라이스를 perfuse 하 고 충분 한 산소를 달성 하기 위해 2-4 mL/min에서 관류 속도 설정 합니다.
- 저해상도 현미경 렌즈를 사용 하 여 SG (반투명 밴드)의 영역을 식별, 건강 한 신경 목표 셀으로 고해상도 목표를 사용 하 여 선택한 비디오 모니터 스크린의 센터에 그것을 조정 합니다.
- K+의 적절 한 볼륨을 채워는 micropipette-기반 또는 Cs+-는 micropipette 전극 홀더에 삽입 고 세포내 솔루션 안에 실버 와이어 연락은 필요에 따라 세포내 솔루션을 기반으로 합니다 홀더입니다.
- 초점으로는 micropipette가지고 micromanipulator를 사용 하 여 실제에 몰입할 고 온화한 긍정적인 압력 (~ 1 psi는 압력 게이지로 측정 하는 때) 적용 모든 먼지와 파편 micropipette 강제로.
- 타겟된 신경 쪽으로 micropipette 점차적으로 이동 합니다. 피펫으로 신경 및 아주 작은 보조 개 형태는 gigaseal를 형성 하기 위하여 신경 막에 접근 하는 일단 긍정적인 압력을 릴리스 합니다.
- 지주-70에 잠재적인 변경 mV, 가까이 생리 적인 휴식 막 잠재적인 (RMP) 셀의. 다음, 과도 하 고 부드러운 흡입 막 파열을 만들 좋은 전체 셀 구성 micropipette 적용 됩니다.
참고: 녹음 실에는 슬라이스를 전송 후 적어도 5 분 조각 표면에 파편을 취소에 대 한 지속적인 관류를 확인 하십시오. 그것은 건강 하 고 건강에 해로운/죽은 신경 세포 사이 구별 하는 능력 좋은 씰링 및 안정적인 기록을 위한 최고 중요성의 지적 가치가 있다. 건강에 해로운/죽은 신경은 보이는 큰 핵 함께 부 또는 긴축 외관, 밝고 부드러운 막으로 3 차원 (3D) 모양 특징 이다 건강 한 신경 및 그것의 핵 표시 되지 않습니다. 전체 셀 구성 달성 하기 위해 필요할 때 단계별 빠르거나 느린 커패시턴스에 대 한 보상을 필수적 이다. RT에 잠재적인 액체 접합은 계산 15.1-15.2 mV 및 k+4.3-4.4 mV-기반 및 Cs+-각각 세포내 솔루션을 기반으로. 우리의 연구에 기록 된 데이터 하지 액체 접합 잠재력에 대 한 수정 했다. - 본질적인 막 속성의 녹음
- 수동 내장 막 속성 기록: 기록 RMP을 즉시 (20 내 s)에서 휴식 후. 전류 클램프 모드에서 RMP에 전압에 대 한 응답 depolarizing 현재 (10 pA, 500 밀리초)를 측정 하 여 신경 입력된 저항을 결정 합니다.
- 기록 속성을 발사: 1의 시리즈와 전류 클램프에 각 뉴런의 발사 패턴을 테스트 전류 펄스 (25 pA 증가와 25-150 pA) RMP에 depolarizing s. 임계값, 진폭 및 오프 라인으로 단일 활동 전위의 반-폭 측정 합니다.
- Subthreshold 전류 기록: 체세포 subthreshold 전류를 평가 하는 막 잠재적인에서 개최-50 mV 전압 클램프 모드에서. 그런 다음 hyperpolarizing-60에서 1 s의 전압 펄스의 시리즈를 적용 mV-120 ~ mV, mV 10 감소.
- 흥분 성의 postsynaptic 전류 (EPSCs) 기록: 기록 EPSCs k+-기반으로-70의 지주 잠재력에 전압 클램프 모드에서 세포내 솔루션 mV.
- 레코드 Ipsc: Cs+적용-Ipsc를 기록 하기 위한 세포내 솔루션을 기반으로. 전체 셀 구성 설정 되 면 막 잠재적인에서 개최-70 mV ~ 5 분, 및 다음 변경 0으로 잠재적인 지주에 대 한 mV 점차적으로. 안정화를 위한 몇 분 그리고 IPSC 이벤트 기록 시작 합니다.
참고:-50 mV 및 표시 오버 슛 보다는 적게는 RMP만 신경 더 학문을 위해 선택 되어야 합니다. 우리의 연구에서 시리즈 저항은 일반적으로 10-30 m ω, 그리고 직렬 저항을 20% 이상 변경 되 면 녹음을 제외 해야 합니다. EPSCs 50 µ M APV의 목욕 응용 프로그램으로 확인 될 수 있는 20 µ m CNQX, Ipsc 10 µ M bicuculline와 1 µ M strychnine 확인 될 수 있는 하는 동안.
5. 형태학 연구
- 형태학 실험에 대 한 사용 K+-0.05% neurobiotin 488을 포함 하는 세포내 솔루션을 기반으로.
- 안정적인 electrophysiological 적어도 20 분에 대 한 기록 유지 후 천천히 봉인 및 컨테이너 4%로 가득 척수 조각 전송 세포 막 수 있도록 위쪽 방향으로 micropipette를 제거 PFA. 수정 조각 4 %PFA 하룻밤에 4 ° C에서 그리고 1 시간에 대 한 실시간에.
- PBS에서 슬라이스를 헹 구 고 30 분 50% 에탄올에 그들을 담가. PBS에서 또 다른 3 개의 세척, 후 슬라이드 장착 매체에 그들의 원래 두께에 슬라이스를 탑재.
- Confocal 현미경을 사용 하 여 ( 재료의 표참조) 이미지 수집 및 신경 3D 재구성. 1.5 µ m의 z-스택 20 X 렌즈를 통해 신경 세포를 검사 합니다.
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Representative Results
급성 척수 조각 그림 1에 표시 된 다이어그램에 따라 준비 되었다. 조각화 및 복구, 후 척수 조각 녹음 실로 옮겨 졌다. 건강 한 신경 소마 모양 IR DIC 현미경을 사용 하 여에 따라 확인 되었다. 다음, SG 뉴런의 활동 전위 전류 펄스 (1 s 기간) depolarizing의 시리즈에 의해 elicited 했다 신경 RMP에서 열렸다. 보이는 것 처럼 그림 2설명 되어 있고 이전 연구에 의해 분류 한 SG 신경 포함 토 닉-발사, 지연 발사에서에서 관찰된, 간격-발사, 초기 버스트, phasic 파열, 단일-스파이크와 꺼 려 발사, 발사 패턴.
이 준비를 구현, 우리 또한 기록 subthreshold 전류 및 자발적으로 나타나는 전류 전압 클램프에. Subthreshold 전류, hyperpolarization-활성화 전류 등의 대표적인 흔적 (내가h), T-타입 칼슘 현재 (IT)와 A 형 칼륨 현재 (IA), 그림 3A에서 제공 됩니다. 이 현재-50에서 셀을 눌러 가져온 mV 및 점차 강화 10 mV 감소에서-60에서-120 mV. 내가h 전압 단계를 hyperpolarizing에 의해 활성화 되었다. 그러나, 나는T 와 나 는 hyperpolarizing prepulses depolarized 전압에 따라 비활성화에서 해제 하 여 활성화 했다. 그림 3B 3 C 대표 자연 EPSCs (sEPSCs) 및 Ipsc (sIPSCs) SG 뉴런에서 각각 기록 표시. 진폭과 주파수의 이러한 시 냅 스 이벤트 미니 분석 소프트웨어를 사용 하 여 오프 라인으로 분석 될 수 있습니다.
신경 형태학 기능 특성, parasagittal 슬라이스 SG 신경의 대부분이 크게 수지상 나무의 rostrocaudal 확산 및 neurobiotin 488 세포내 솔루션에 추가 되었습니다 때문에 적용 되었다. 신경 소마와 넓이의 크기와 그들의 수지상 프로세스의 크기는 confocal 현미경 이미징 후 평가 했다. 이전에 보고 된, SG 뉴런 형태소 구분을 표시 하 고 중앙 셀, 방사형 셀, 수직 셀, 작은 섬 세포 및 분류 되지 않은 세포로 분류 될 수 있습니다. 이러한 셀의 대표 현미경 그림 4에 나와 있습니다.
그림 1: 급성 척수 조각 준비에 대 한 다이어그램. 깊이 urethan (i.p.)와 취 되 고, 후 쥐는 transcardially 얼음 carbogenated 자당-실제와 함께 끼얹는다입니다. 척추는 다음 신속 하 게 해 부, 그리고 복 부 laminectomy 수행 됩니다. Meninges, 피아-거미 집 모양의 막과 연결 된 척추 신경 뿌리는 제거 됩니다. 그런 다음, 척수 견본 agarose 블록에 장착 됩니다. 필요에 따라 가로 또는 parasagittal 슬라이스는 vibratome와 절단 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: SG 뉴런의 패턴을 발사. 1의 시리즈를 주입 하 여 발사 패턴 결정 s RMP에 SG 신경에 전류 펄스를 depolarizing. 로 토 닉-발사, 지연 발사, 간격-발사, 초기 버스트, phasic 파열, 단일-스파이크, 및 꺼 려 발사 발사 패턴 분류 될 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: SG 뉴런에서 전압 클램프 녹음. (A) 대표 추적 hyperpolarizing로 분류 하는 현재 분사에 대 한 응답을 보여주는h, IA 와 IT. 하단 패널 전압 클램프에 하위 임계값 전류에 대 한 차분한 프로토콜을 보여 줍니다. (B) sEPSCs의 대표적인 흔적-70에서 SG 뉴런에서 기록 부재 및 50 μ M APV의 존재에 mV 및 20 μ M CNQX. 하기 전 (왼쪽) 확장된 시간 척도에 표시 되는 연속 추적 내리고 APV CNQX의 액션 바 차트 기록 아래에 표시 된 기간에 해당 하는 (오른쪽)에서. (C) sIPSCs의 대표적인 흔적 부재 및 10 μ M bicuculline 및 0에서 1 μ M strychnine에 SG 뉴런에서 기록 mV. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 쥐 SG 뉴런의 대표적인 형태. 소마 크기와 모 수석 속성 confocal 현미경 이미지에 표시 된, SG 신경 중앙 셀 (A), 방사형 셀 (B), 수직 셀 (C), 작은 섬 세포 (D) 및 분류 되지 않은 셀 (E 로 분류 될 수 있습니다. ). 된 복 부; D: 등 쪽; R: rostral; C: 꼬리. 눈금 막대 = 50 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 구성 요소 | 분자량 | 농도 (mM) | g/L |
| NaCl | 58.5 | 117 | 6.84 |
| KCl | 74.5 | 3.6 | 0.27 |
| NaH2포4·2H2O | 156 | 1.2 | 0.19 |
| CaCl2·2H2O | 147 | 2.5 | 0.37 |
| MgCl2·6H2O | 203 | 1.2 | 0.24 |
| NaHCO3 | 84 | 25 | 2.1 |
| D-포도 당 | 180 | 11 | 1.98 |
| 의약품 | 198.11 | 0.4 | 0.08 |
| 나트륨 pyruvate | 110 | 2 | 0.22 |
표 1: 실제에 대 한 제조 법입니다.
| 구성 요소 | 분자량 | 농도 (mM) | g/L |
| NaCl | 58.5 | 117 | 6.84 |
| KCl | 74.5 | 3.6 | 0.27 |
| NaH2포4·2H2O | 156 | 1.2 | 0.19 |
| CaCl2·2H2O | 147 | 2.5 | 0.37 |
| MgCl2·6H2O | 203 | 1.2 | 0.24 |
| NaHCO3 | 84 | 25 | 2.1 |
| D-포도 당 | 180 | 11 | 1.98 |
| 의약품 | 198.11 | 0.4 | 0.08 |
| 나트륨 pyruvate | 110 | 2 | 0.22 |
표 2: 자당-실제에 대 한 제조 법입니다.
| 구성 요소 | 분자량 | 농도 (mM) | mg/100 mL |
| K-글 루 콘 산 | 234.2 | 130 | 3044.6 |
| KCl | 74.5 | 5 | 37.28 |
| 나2-Phosphocreatine | 453.38 | 10 | 453.38 |
| EGTA | 380.35 | 0.5 | 19.02 |
| HEPES | 238.31 | 10 | 238.3 |
| Mg-ATP | 507.18 | 4 | 202.9 |
| 리-GTP | 523.18 | 0.3 | 15.7 |
표 3: 길목 K+-세포내 솔루션을 기반으로.
| 구성 요소 | 분자량 | 농도 (mM) | mg/100 mL |
| CsMeSO4 | 228 | 92 | 2097.6 |
| CsCl | 168.36 | 43 | 723.95 |
| 나2-Phosphocreatine | 453.38 | 10 | 453.38 |
| 차-Cl | 165.71 | 5 | 82.86 |
| EGTA | 380.35 | 0.5 | 19.02 |
| HEPES | 238.31 | 10 | 238.3 |
| Mg-ATP | 507.18 | 4 | 202.9 |
| 리-GTP | 523.18 | 0.3 | 15.7 |
표 4: 길목 Cs+-세포내 솔루션을 기반으로.
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Discussion
이 프로토콜 세부 SG 뉴런18,19,,2021에 전체 셀 패치 클램프 실험을 수행할 때 우리가 성공적으로 사용한 척수 조각 준비 단계. 이 메서드를 구현 하 여 우리는 최근 그 minocycline 보고 차세대 항생물질, 현저 하 게 SG 뉴런19에 연 접 메커니즘을 통해 억제 시 냅 스 전송 향상 시킬 수 있는. 또한,이 에이전트는h 의 진폭을 감소 하 고 더 SG 뉴런21의 흥분을 억제 수 있습니다. 이러한 지원 게시 데이터 및 대표 결과 우리가 여기에 표시, 현재 설명 방법은 electrophysiological 연구의 넓은 범위에서 사용 하기에 적합.
우리는 이전에 언급 transcardial 관류 건강 한 견본을 얻기 위한 중요 한 요소 이다. 첫째, 우리가 사용할 얼음 솔루션 관류에 대 한 척수 급속 하 게 냉각 될 수 있다 그래서 신경 대사 둔화22일 수 있다. 둘째, 자당 대체 실제, 낮은 Na+ 농도와 '보호 절단' 솔루션은 수동 나+ 유입 개량 하 고 따라서 물 항목23통해 신경 부 종 감소 수 있습니다. 셋째, 관류 biocytin22기인 배경 최소화할 수 있기 때문에 신경 원 형태학을 분석 하는 도움이 됩니다. 성공적인 준비에 대 한 그것은 또한 신경 보존24수 있는 산화 손상을 줄이기 위해 몇 가지 항 산화를 사용 하는 것이 중요. 따라서, 우리의 프로토콜에서 우리 의약품 및 나트륨 pyruvate, 강력한 산화 방지 제는 효과적으로, 실제에 자당 실제 척수 조각에서 부 종을 개량 하다 수 보충. 또한, 우리의 경험에서 우리가 얻을 수 있습니다 건강 한 척수 조각 성공적으로 3-10 주 뿐만 아니라 신생아에서 오래 된 SD 쥐. 따라서, 성공을 위해이 프로토콜에 대 한 10 주 미만 SD 쥐를 사용 하 여 것이 좋습니다.
동안 '복 부' laminectomy 수행 및 제거 meninges 및 척수 신경, 한 환자 및 절단, 스트레칭 또는 척수를 분할 하지 않도록 주의 해야 합니다. 일부 연구에 연결 된 지 뿌리와 척수 조각 사용 되었습니다 평가 시 냅 스 전송 SG 뉴런 받은 주변25,26. 피아-거미 집 모양의 막 제거의 절차는 기술적인 어려움의이 경우에, 그리고 그것은 인내심이 많이 필요 합니다.
이 조각 기법 또한 준비는 몇 가지 제한이 있습니다. 한 명확한 단점은 급성 조각 풍부한 시 냅 스 연결을 유지 하는 있지만 수 없습니다 진짜 상태를 반영을 비보를 정확 하 게 어떻게 주소. 따라서, 몇몇 학문 vivo에서 구현한 일반적으로 녹음 수행 '블라인드'27,,2829. 그러나, vivo에서 이렇게 기술적으로 도전 이며 녹음 소마 또는 충분 한 경험 없이 모 수석에서 수행 여부를 말할 어렵다. 우리의 현재 방법의 또 다른 한계는 설치류를 노화에서 분할 영역을 준비할 때 그 자당-실제 신경 보존에 대 한 충분 한 않을 수 있습니다. 업데이트 방법을 사용 하 여 N-메 틸-D-glucamine 나+ 대체 제안 되었습니다,이 최적화 방법론 현저 하 게 급성 조각30,31에서에서 신경 세포의 형태와 기능 보존을 향상 시킬 수 있습니다. ,,3233. 마지막으로, SG 뉴런 다른 형태학 및 electrophysiological 속성3을 표시합니다. 이 내려다 보이는 하는 동안 전체 세포 기록에서 얻은 데이터를 해석 하기 어려운 것 같다. 이 제한에 의해 sidestepped 수 있습니다 추가의 형태학 세부 기록 뉴런5 확인 또는 연구원을 도울 수 있는 유전자 변형 쥐를 사용 하 여 식별 특정 뉴런20,34. 또한, optogenetics, 셀35, 하위 인구의 제어를 허용 하는 소설 도구 전체 셀 패치 클램프 기록 특정 이온 채널 단백질의 역할을 연구 하 고 특정 신경 회로 조사와 결합 될 수 있었다.
전반적으로,이 준비 기술은 SG 뉴런, 패치 클램프 기록, immunofluorescent 얼룩, 특정 보완의 electrophysiological, 형태학, 약리, 및 생물 학적 특성을 조사 하는 이상적인 방법입니다. 주 작동 근 또는 길 항 근, 및 단일 셀 RT-PCR 기술. 또한,이 이렇게 대응된 패치 클램프 기록 또는 optogenetics, 적용 될 수 있다 그리고 그것은 따라서 신경 칩을 계몽 하기 위한 유용한 도구.
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Disclosures
저자는 관심 없음 충돌 선언합니다.
Acknowledgments
이 작품은 국립 자연 과학 재단의 중국 (No. 81560198, 31660289)에서 교부 금에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Sigma | S7653 | Used for the preparation of ACSF and PBS |
| KCl | Sigma | 60130 | Used for the preparation of ACSF, sucrose-ACSF, and K+-based intracellular solution |
| NaH2PO4·2H2O | Sigma | 71500 | Used for the preparation of ACSF, sucrose-ACSF and PBS |
| CaCl2·2H2O | Sigma | C5080 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
| MgCl2·6H2O | Sigma | M2670 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
| D-Glucose | Sigma | G7021 | Used for the preparation of ACSF |
| Ascorbic acid | Sigma | P5280 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
| Sodium pyruvate | Sigma | A7631 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
| Sucrose | Sigma | S7903 | Used for the preparation of sucrose-ACSF |
| K-gluconate | Wako | 169-11835 | Used for the preparation of K+-based intracellular solution |
| Na2-Phosphocreatine | Sigma | P1937 | Used for the preparation of intracellular solution |
| EGTA | Sigma | E3889 | Used for the preparation of intracellular solution |
| HEPES | Sigma | H4034 | Used for the preparation of intracellular solution |
| Mg-ATP | Sigma | A9187 | Used for the preparation of intracellular solution |
| Li-GTP | Sigma | G5884 | Used for the preparation of intracellular solution |
| CsMeSO4 | Sigma | C1426 | Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution |
| CsCl | Sigma | C3011 | Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution |
| TEA-Cl | Sigma | T2265 | Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution |
| Neurobiotin 488 | Vector | SP-1145 | 0.05% neurobiotin 488 could be used for morphological studies |
| Agar | Sigma | A7002 | 3% agar block was used in our protocol |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | 4% paraformaldehyde was used for immunohistochemical processing |
| Na2HPO4 | Hengxing Chemical Reagents | Used for the preparation of PBS | |
| Mount Coverslipping Medium | Polyscience | 18606 | |
| Urethan | National Institute for Food and Drug Control | 30191228 | 1.5 g/kg, i.p. |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | TW150F-4 | 1.5 mm OD, 1.12 mm ID |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | Used for the preparation of micropipettes |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| Vibration isolation table | Technical Manufacturing Corporation | 63544 | |
| Infrared CCD camera | Dage-MIT | IR-1000 | |
| Patch-clamp amplifier | HEKA | EPC-10 | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | MP-285 | |
| X-Y stage | Burleigh | GIBRALTAR X-Y | |
| Upright microscope | Olympus | BX51WI | |
| Osmometer | Advanced | FISKE 210 | |
| PH meter | Mettler Toledo | FE20 | |
| Confocol microscope | Zeiss | LSM 700 |
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