リアルタイム可視化と完全にそのままマウス軟骨外植片の機械的荷重により軟骨損傷の解析
Summary
アプリケーション制御の機械的負荷や衝撃の後そのままマウス関節の関節面の細胞傷害/死の空間範囲を評価する方法を提案します。このメソッドは、どのように変形性関節症、遺伝的要因や異なる負荷療法上皮内軟骨細胞の脆弱性に影響を調査するため使用できます。
Abstract
関節軟骨の恒常性は、細胞 (軟骨) の生存率に依存します。残念ながら、機械的外傷関節の不可逆的な破壊と変形性関節症の発症につながる可能性のある広範な軟骨細胞死を引き起こすことができます。さらに、軟骨細胞生存率の維持は、最適な手術成績骨軟骨移植の手順で重要です。アプリケーション制御の機械的負荷や衝撃の後そのままマウス滑膜関節の関節面の細胞傷害/死の空間範囲を評価する方法を提案します。このメソッドは、異なる機械的負荷のレジメン、異なる環境条件や遺伝子操作の効果だけでなく、短期および長期の軟骨変性のさまざまな段階を調査する比較研究で使用できます。その場で関節軟骨の脆弱性。原稿で導入されたプロトコルの目的は、マウス、関節滑膜関節の表面に細胞傷害/死の空間範囲を評価するためです。重要なは、このメソッドは、ネイティブの境界条件を損なうことがなく完全にそのまま軟骨をテストできます。さらに、極めてステンド グラス関節軟骨細胞のリアルタイムの可視化と制御静的および衝撃療法の応用による細胞傷害の単一イメージ ベース解析が可能です。当社の代表的な結果は、健康な軟骨分化の細胞損傷の空間的な範囲に依存する敏感に負荷の大きさと影響の強度を示しています。手法は異なる機械的負荷のレジメン、異なる環境条件やその場で関節軟骨の機械的脆弱性の異なる遺伝的操作の効果を調査するために容易に適応することができます。
Introduction
関節軟骨 (AC) は、荷重をカバーし、滑らかな関節関節を提供する滑膜関節の骨を保護する組織です。組織恒常性は、AC に存在する唯一の細胞型軟骨細胞の生存率に依存しています。しかし、軟骨の外傷 (例えば滝、車両事故やスポーツ傷害) または外傷後関節不安定性による極端な力への暴露はジョイント (関節) の不可逆的な破壊につながる、軟骨細胞の死を引き起こすことができます。1。 さらに、骨軟骨損傷した軟骨の局所欠陥を修復を目指して手続きを移植、移植挿入関連機械外傷は軟骨細胞生存率を低減と手術成績2に有害な影響を及ぼします。
軟骨植モデルは、機械的に誘発される細胞死に関節軟骨細胞の感受性を研究に使用されます。これらのモデルは通常、荷重条件、環境条件、およびセルの脆弱性3,4,5,6,を他の要因の効果を研究する大型動物から植を使用7,8,9,10、11,12,13,14,15。ただし、ネイティブの接合部のサイズが大きいためこれらのモデル一般的にネイティブの境界条件を損なうことにより、そのまま関節の関節面からプラグの取り外しが必要です。また、一般的に細胞傷害を誘発する大きな機械的負荷のアプリケーションが必要です。また、マウスの軟骨植モデルはその場で軟骨の機械的脆弱性の勉強に大規模な動物モデルにいくつかの利点を提供します。特に、自分の小さな寸法のためこれらのモデルはネイティブの組織の整合性を変更することがなく完全にそのまま軟骨のテストを促進します。さらに、マウスの軟骨の読み込みが発生した小さな接触領域に小さな負荷で軟骨細胞死、傷害を誘起すること (< 1 N)。最後に、マウスのゲノムは、どのように特定の遺伝子の影響の場で軟骨の機械的損傷に対する感受性のテストを有効にする簡単に、操作されます。
本稿で紹介したメソッドの全体的な目標を定量化する、視覚化の原細胞死/完全にそのままマウスの軟骨を骨に機械的荷重による損傷のリアルタイム時間の空間範囲が体外を外植体します。このメソッドは、我々 が最近開発したテストプラット フォームに似て顕微鏡マウント デバイスを使用して極めてステンド グラス植の機械試験続いて軟骨細胞生存率を損なうことがなくマウス、関節滑膜を細かくを必要とマウス軟骨の力学特性の16を定量化します。機械試験中に切り裂かれた骨 (そのまま) 関節面の大部分は負荷を適用した後の細胞生存率の迅速分析を有効にする、単一の蛍光顕微鏡写真に表示されます。以前は、なくロード17の同時適用マウス軟骨外植片の表面細胞生存率の同様の分析を行った。本手法の潜在的なアプリケーションは、さまざまな制御環境と力学的条件、関節軟骨細胞の脆弱性だけでなく、スクリーニング感度を減らすことを目的とした治療法の比較研究機械的負荷に軟骨。
Protocol
Representative Results
Discussion
上記の方法は、機械的負荷や衝撃を規定すた後マウスの関節から関節軟骨現実的で負傷/デッドその場を可視化する正常に採用されました。特に、2 つの異なる関節から完全にそのまま軟骨内軟骨細胞の力学的脆弱性を分析することができました: 膝関節 (遠位大腿骨) と肩 (上腕骨)。当社の代表的な結果を示す細胞傷害関節面上の空間範囲が荷重の大きさと影響の強さ (?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、pH メーター、osmometer の寛大な使用のため博士リチャード ・ ウォーとルイス Delgadillo を感謝したいです。さらに、著者はアンドレア ・李のメカニカル テスト システムの初期開発への貢献をありがとうたいと思います。この研究は、NIH P30 AR069655 によって賄われていた。
Materials
| Calcein, AM | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | C3100MP | 20x50mg , Eugene, OR, USA |
| Propidium Iodide | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | P3566 | 1 mg/mL solution in water, 10mL, Eugene, OR, USA |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 276855 | 1L DMSO, anhydrous, ≥99.9%, St. Louis, MO, USA |
| HBSS (calcium, magnesium, no phenol red) | Gibco by Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | 1X, 500mL, Grand Island, NY, USA |
| Feather surgical blade (#11) | VWR | 102097-822 | Hatfield, PA, USA |
| Vapor pressure osmometer, VAPRO | ELITechGroup | Model 5520 | Puteaux, France |
| pH meter | Beckman | Model Phi 32 | Brea, CA, USA |
| Eppendorf thermomixer | Eppendorf AG | Model 5350 | Hamburg, Germany |
| Motorized inverted research microscope | Olypmus | Model IX-81 | Center Valley, PA, USA |
| Wooden applicator | Puritan Medical Products Company, LLC | 807 | 6"x100, Guilford, ME, USA |
| 1.5 Glass coverslips | Warner Instruments, LLC | 64-1696 | #1.5, 0.17mm thick, 40mm diameter, Hamden, CT, USA |
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