Visualização em tempo real e análise do condrócito prejuízo devido ao carregamento mecânico em explantes de cartilagem murino totalmente intacta
Summary
Apresentamos um método para avaliar a extensão espacial da lesão/morte celular na superfície articular das articulações murino intactas após a aplicação de cargas mecânicas controladas ou impactos. Esse método pode ser usado para investigar como osteoartrite, fatores genéticos e/ou regimes de carregamento diferentes afetam a vulnerabilidade dos condrócitos em situ .
Abstract
Homeostase da cartilagem articular depende a viabilidade de células residentes (condrócitos). Infelizmente, o trauma mecânico pode induzir morte condrócito generalizada, podendo levar a colapso irreversível da articulação e o aparecimento da osteoartrite. Além disso, a manutenção da viabilidade de condrócitos é importante nos procedimentos de enxerto osteocondral para óptimos resultados cirúrgicos. Apresentamos um método para avaliar a extensão espacial da lesão/morte celular na superfície articular das articulações sinoviais murino intactas após a aplicação de cargas mecânicas controladas ou impactos. Esse método pode ser usado em estudos comparativos para investigar os efeitos de carregamento mecânico diferentes regimes, diferentes condições ambientais ou manipulações genéticas, bem como estágios diferentes da degeneração da cartilagem em curto e / ou a longo prazo vulnerabilidade de condrócitos articulares in situ. O objetivo do protocolo introduzido no manuscrito é avaliar a extensão espacial da lesão/morte celular na superfície articular das articulações sinoviais murino. Importante, esse método permite que o teste na cartilagem totalmente intacta, sem comprometer as condições de contorno nativas. Além disso, permite a visualização em tempo real de condrócitos articulares vital manchadas e única análise baseada em imagem de lesão celular induzida pela aplicação de controlada estática e regimes de carga de impacto. Nossos resultados representativos demonstram que em explantes de cartilagem saudável, a extensão espacial do ferimento da pilha depende sensivelmente intensidade magnitude e o impacto de carga. Nosso método pode ser facilmente adaptado para investigar os efeitos de carregamento mecânico diferentes regimes, diferentes condições ambientais ou manipulações genéticas diferentes na vulnerabilidade de mecânica de em situ condrócitos articulares.
Introduction
Cartilagem articular (AC) é uma tecido que cobre e protege os ossos nas articulações sinoviais, proporcionando suave articulação conjunta de rolamento de carga. Homeostase do tecido é dependente da viabilidade de condrócitos, o tipo de célula única que residem em AC. No entanto, exposição da cartilagem a forças extremas devido a um trauma (por exemplo, quedas, lesões desportivas ou acidente de veículo) ou devido à instabilidade articular pós-traumática pode induzir a morte de condrócitos, levando à desagregação irreversível da articulação (artrose) 1. Além disso, em osteocondrais enxertia procedimentos que visam reparar defeitos locais na cartilagem danificada, trauma mecânico associada a inserção de enxerto reduz a viabilidade de condrócitos e tem efeitos prejudiciais sobre os resultados cirúrgicos2.
Modelos de explante de cartilagem são comumente usados para estudar a susceptibilidade de condrócitos articulares à morte celular induzida mecanicamente. Estes modelos normalmente usam explantes de animais de grandes porte para estudar os efeitos do carregamento de condições, condições ambientais e outros fatores na célula vulnerabilidade3,4,5,6, 7,,8,9,10,11,12,13,14,15. No entanto, devido ao grande tamanho das articulações nativos, estes modelos geralmente exigem a remoção de um plug de superfície articular de uma articulação intacta, comprometendo desse modo nativas condições de contorno. Além disso, eles geralmente requerem a aplicação de grandes cargas mecânicas para induzir lesão celular. Alternativamente, modelos de explante de cartilagem murino oferecem diversas vantagens sobre os modelos animais maiores em estudar a vulnerabilidade mecânica dos condrócitos em situ . Em particular, devido a suas pequenas dimensões, estes modelos facilitam testes de cartilagem articular totalmente intacta, sem alterar a integridade do tecido nativo. Além disso, carregamento de cartilagem murino ocorre ao longo de pequenas áreas de contato tal que condrócito morte/lesão pode ser induzida com cargas pequenas (< 1 N). Finalmente, o genoma do rato é facilmente manipulado, permitindo o teste de impacto de genes específicos como a susceptibilidade de condrócitos em situ à injúria mecânica.
O objectivo geral do método introduzido neste manuscrito é quantificar e Visualizar-em real-time, o extensão espacial da morte/ferimento da pilha em situ devido a cargas mecânicas aplicadas na cartilagem totalmente intacto do mouse-na-osso explants in vitro. Este método requer a dissecção cuidadosa das articulações sinoviais rato sem comprometer a viabilidade de condrócitos, seguida de teste mecânico de explantes vital manchadas usando um microscópio montado dispositivo semelhante a uma plataforma de teste que desenvolvemos recentemente para quantificar a cartilagem murino propriedades mecânicas16. Durante o ensaio mecânico, uma grande parte da superfície articular (intacta) do osso dissecado é visível em uma micrografia de fluorescência único, permitindo uma análise rápida da viabilidade celular, depois de uma carga é aplicada. Uma análise similar da viabilidade de superfície celular na cartilagem murino explantes foi realizada anteriormente, mas sem aplicação simultânea de carga17. As aplicações potenciais do nosso método incluem estudos comparativos para investigar a vulnerabilidade dos condrócitos articulares para diferentes condições ambientais e mecânicas controladas, bem como a triagem de tratamentos que visam a redução da sensibilidade de condrócitos para carregamento mecânico.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os métodos descritos acima foram empregados com sucesso para visualizar viável e feridos/mortos em situ condrócitos articulares das articulações do mouse depois prescrito cargas mecânicas ou impactos. Em particular, fomos capazes de analisar a vulnerabilidade mecânica dos condrócitos na cartilagem articular totalmente intacto de dois diferentes articulações sinoviais: a articulação do joelho (fêmures distais) e ombro (úmeros). Nossos representante resultados mostram que a extensão espacial do feri…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostaria de agradecer o Dr. Richard Waugh e Luis Delgadillo para o uso generoso de seu medidor de pH e aparelhos. Além disso, os autores gostaria agradecer a Andrea Lee para contribuir para o desenvolvimento inicial do sistema de teste mecânico. Este estudo foi financiado pelo NIH P30 AR069655.
Materials
| Calcein, AM | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | C3100MP | 20x50mg , Eugene, OR, USA |
| Propidium Iodide | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | P3566 | 1 mg/mL solution in water, 10mL, Eugene, OR, USA |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 276855 | 1L DMSO, anhydrous, ≥99.9%, St. Louis, MO, USA |
| HBSS (calcium, magnesium, no phenol red) | Gibco by Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | 1X, 500mL, Grand Island, NY, USA |
| Feather surgical blade (#11) | VWR | 102097-822 | Hatfield, PA, USA |
| Vapor pressure osmometer, VAPRO | ELITechGroup | Model 5520 | Puteaux, France |
| pH meter | Beckman | Model Phi 32 | Brea, CA, USA |
| Eppendorf thermomixer | Eppendorf AG | Model 5350 | Hamburg, Germany |
| Motorized inverted research microscope | Olypmus | Model IX-81 | Center Valley, PA, USA |
| Wooden applicator | Puritan Medical Products Company, LLC | 807 | 6"x100, Guilford, ME, USA |
| 1.5 Glass coverslips | Warner Instruments, LLC | 64-1696 | #1.5, 0.17mm thick, 40mm diameter, Hamden, CT, USA |
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