Visualización en tiempo real y análisis de la lesión de condrocitos debido a cargas mecánicas en explantes de cartílago murino intacta
Summary
Se presenta un método para evaluar la extensión espacial de las lesiones o la muerte de la célula en la superficie articular de articulaciones murinas intactas después de la aplicación de cargas mecánicas controladas o impactos. Este método puede utilizarse para investigar cómo osteoartritis, factores genéticos o los regímenes de carga diferentes afectan la vulnerabilidad de los condrocitos en situ .
Abstract
La homeostasis del cartílago articular depende de la viabilidad de las células residentes (condrocitos). Lamentablemente, trauma mecánico puede inducir la muerte de condrocitos generalizada, puede conducir a la ruptura irreversible de la articulación y la aparición de la artrosis. Además, el mantenimiento de la viabilidad de los condrocitos es importante en los procedimientos de injerto osteocondral de resultados quirúrgicos óptimos. Se presenta un método para evaluar la extensión espacial de las lesiones o la muerte de la célula en la superficie articular de las articulaciones sinoviales murinas intactas después de la aplicación de cargas mecánicas controladas o impactos. Este método puede utilizarse en estudios comparativos para investigar los efectos de los regímenes de cargas mecánicas diferentes, diferentes condiciones ambientales o manipulación genética, así como diferentes etapas de la degeneración del cartílago en corto o a largo plazo vulnerabilidad de los condrocitos articulares in situ. El objetivo del protocolo presentado en el manuscrito es evaluar la extensión espacial de las lesiones o la muerte de la célula en la superficie articular de las articulaciones sinoviales murinas. Importante, este método permite la prueba en el cartílago completamente intacto sin comprometer condiciones nativas. Además, permite la visualización en tiempo real de los condrocitos articulares tinción vital y único análisis basado en imágenes de la lesión celular inducida por la aplicación de static control y regímenes de carga de impacto. Nuestros resultados representativos demuestran que en explantes de cartílago sano, la extensión espacial de la lesión de la célula depende de sensible intensidad de magnitud y el impacto de carga. Nuestro método puede adaptarse fácilmente para investigar los efectos de los regímenes de cargas mecánicas diferentes, diferentes condiciones ambientales o diferentes manipulaciones genéticas de la vulnerabilidad de la mecánica de en situ condrocitos articulares.
Introduction
Cartílago articular (CA) es una tejido que recubre y protege los huesos en las articulaciones sinoviales, proporcionando suave articulación conjunta de carga. Homeostasis del tejido depende de la viabilidad de los condrocitos, el tipo de célula única que reside en la CA. Sin embargo, exposición del cartílago a fuerzas extremas debido al trauma (p. ej., cataratas, lesiones accidente o deportes) o debido a la inestabilidad postraumática de la articulación puede inducir la muerte de condrocitos, conduciendo a la degradación irreversible de la articulación (artrosis) 1. Además, en osteocondral procedimientos que tienen por objeto reparar los defectos locales en cartílago dañado de injertos, trauma mecánico asociado de inserción del injerto reduce la viabilidad de los condrocitos y tiene efectos perjudiciales en los resultados quirúrgicos2.
Modelos de explantes de cartílago se utilizan para estudiar la susceptibilidad de los condrocitos articulares a la muerte celular inducida mecánicamente. Estos modelos normalmente utilizan explantes de animales grandes para estudiar los efectos de carga de las condiciones, las condiciones ambientales y otros factores celulares vulnerabilidad3,4,5,6, 7,8,9,10,11,12,13,14,15. Sin embargo, debido al gran tamaño de las articulaciones nativas, estos modelos generalmente requieren remoción del tapón de la superficie articular de una articulación intacta, tal modo comprometer condiciones nativas de. Por otra parte, generalmente necesitan de aplicación de cargas mecánicas grandes para inducir lesión de la célula. Por otra parte, cartílago murino explante modelos ofrecen varias ventajas sobre los modelos animales más grandes en el estudio de la vulnerabilidad mecánica de condrocitos en situ . En particular, debido a sus dimensiones más pequeñas, estos modelos facilitan pruebas del cartílago articular intacta sin alterar la integridad del tejido propio. Además, carga del cartílago murino se produce en pequeñas áreas de contacto tales que la muerte, lesión de condrocitos puede ser inducida con cargas pequeñas (< 1 N). Por último, el genoma del ratón es manipulado fácilmente, permitiendo pruebas de impacto cómo específico de genes de la susceptibilidad de los condrocitos en situ a lesión mecánica.
El objetivo general del método introducido en este manuscrito es cuantificar y visualizar en real-time-la extensión espacial de situ en muerte/lesión de la célula debido a cargas mecánicas aplicadas en ratón intacta cartílago en hueso de explantes in vitro. Este método requiere la disección cuidadosa de articulaciones sinoviales ratón sin comprometer la viabilidad de condrocitos, seguido de ensayos mecánicos de los explantes vital manchados usando un microscopio montado dispositivo similar a una plataforma de pruebas que recientemente desarrollados cuantificar murino cartílago propiedades mecánicas16. Durante la prueba mecánica, una gran parte de la superficie articular (intacta) del hueso disecado es visible en una micrografía de fluorescencia sola, lo que permite un análisis rápido de la viabilidad celular después se aplica una carga. Un análisis similar de la viabilidad de la superficie celular en explantes de cartílago murino se ha realizado previamente, pero sin el uso simultáneo de carga17. Posibilidades de aplicación de nuestro método incluyen estudios comparativos para investigar la vulnerabilidad de los condrocitos articulares a diferentes condiciones ambientales y mecánicas controladas, así como la investigación de tratamientos para reducir la sensibilidad de los condrocitos a la carga mecánica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los métodos descritos anteriormente se emplearon con éxito para visualizar viable y heridos o muertos en situ condrocitos articulares de las articulaciones del ratón después de prescribir cargas mecánicas o impactos. En particular, hemos sido capaces de analizar la vulnerabilidad mecánica de condrocitos en el cartílago articular intacta de dos articulaciones sinoviales diferentes: la articulación de la rodilla (fémur distal) y hombro (Húmeros). Nuestros resultados representativos muestran que la extens…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer al Dr. Richard Waugh y Luis Delgadillo el uso abundante de su medidor de pH y osmómetro. Además, los autores desean agradecer a Andrea Lee por contribuir al desarrollo inicial del mecánica del sistema de prueba. Este estudio fue financiado por los NIH P30 AR069655.
Materials
| Calcein, AM | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | C3100MP | 20x50mg , Eugene, OR, USA |
| Propidium Iodide | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | P3566 | 1 mg/mL solution in water, 10mL, Eugene, OR, USA |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 276855 | 1L DMSO, anhydrous, ≥99.9%, St. Louis, MO, USA |
| HBSS (calcium, magnesium, no phenol red) | Gibco by Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | 1X, 500mL, Grand Island, NY, USA |
| Feather surgical blade (#11) | VWR | 102097-822 | Hatfield, PA, USA |
| Vapor pressure osmometer, VAPRO | ELITechGroup | Model 5520 | Puteaux, France |
| pH meter | Beckman | Model Phi 32 | Brea, CA, USA |
| Eppendorf thermomixer | Eppendorf AG | Model 5350 | Hamburg, Germany |
| Motorized inverted research microscope | Olypmus | Model IX-81 | Center Valley, PA, USA |
| Wooden applicator | Puritan Medical Products Company, LLC | 807 | 6"x100, Guilford, ME, USA |
| 1.5 Glass coverslips | Warner Instruments, LLC | 64-1696 | #1.5, 0.17mm thick, 40mm diameter, Hamden, CT, USA |
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