重症患者における全血エンドトキシア血症の検出に関するエンドトキシン活性アッセイ
Summary
我々は、本明細書を、ヒト全血試料のエンドトキシン活性をベッドサイドで測定するプロトコルを提示する。エンドトキシン活性アッセイは、実行するための簡単なテストであり、敗血症の重症患者に有用なバイオマーカーである可能性があります。
Abstract
リポ多糖類は、エンドトキシンとしても知られており、グラム陰性細菌の基本的な構成要素であり、敗血症および敗血症性ショックの発症に重要な役割を果たしている。重大な病気に急速に進化している感染プロセスの早期同定は、より迅速かつより集中的な治療を促し、それによってより良い患者の結果につながる可能性がある。エンドトキシン活性(EA)アッセイは、全身性エンドトキセミアの信頼性の高いバイオマーカーとしてベッドサイドで使用することができる。高められたエンドトキシン活性レベルの検出は、敗血症および敗血症性ショック患者における疾患重症度の増加に関連することが繰り返し示されている。アッセイは迅速かつ簡単に実行できます。簡単に言えば、サンプリング後、全血のアリコートを抗エンドトキシン抗体と添加したLPSと混合する。エンドトキシン活性は、化学発光によって検出されるプライミング好中球の相対的な酸化バーストとして測定される。アッセイの出力は、0 (不在) から 1 (最大) までのスケールで表され、「低」(<0.4 単位)、「中間」(0.4~ 0.59 単位)、または "高" (≥0.6 単位) に分類されます。EAアッセイの実施のための詳細な方法論と根拠は、この原稿で報告される。
Introduction
リポ多糖類(LPS)は、エンドトキシンとしても知られており、グラム陰性(GN)細菌の膜構造の重要な構成要素である。これは、細胞壁の約10%を構成し、外膜の完全性と恒常性のために不可欠です。また、宿主自然免疫系1、2の強力な活性化剤である。
LPSへの自然免疫系細胞のインビトロ暴露は、複数の遺伝子3の発現の変化につながる。健康なヒトボランティアにおける非常に少量のLPSの投与は急性全身性炎症のカスケードを引き起こすが、敗血症および敗血症性ショックは、より高いエンドトキシン濃度4、5で生じる可能性がある。
敗血症は生命を脅かす状態であり、速やかに認識されなければ、多臓器不全や死に至る可能性がある。敗血症患者は、積極的な蘇生、適切な抗生物質療法、最適なソース管理、迅速な臓器支援戦略を備え、タイムリーに治療する必要があります。敗血症の病因の診断は、主に臨床認識および培養ベースの病原体検出6に基づいている。しかし、微生物培養の結果は48時間までかかることがあり、症例7の30%まで決定的ではない。早期の同定と介入は、より良い患者の結果につながる可能性があります。敗血症が疑われる患者では、内分泌血症の明確な兆候なしに、生理学的および生化学的パラメータに基づいて決定が行われることが多い。
エンドトキシン活性(EA)の測定は、全血中の市販アッセイ(材料の表を参照)によって得ることができる。これは、疾患重症度の早期階層化のための全身性エンドトキシア血症のバイオマーカーとして使用することができ、特に敗血症性ショック8を発症するリスクのある患者において。このアッセイは、敗血症性ショック9の患者における最近発表された二重盲検無作為化対照臨床試験においてポリミキシンBヘモパーフュージョン療法を導くために使用された。重篤な患者では、MEDIC研究は、多臓器機能障害、集中治療室(ICU)滞在期間、および死亡率10に関連するEAレベルの増加を示した。
エンドトキシンを検出するために異なるアッセイが開発されました。Limulusアメーボサイトライサート(LAL)アッセイは、ゲル凝固、濁膜、または発色検査のいずれかとして、これまでで最も頻繁に血清エンドトキシンの推定のために採用されています。これは、エンドトキシンがホースシューカニ、リムルスポリフェムスのヘモリンフの凝固を誘導する能力に基づいている。しかし、このアッセイには特異性の点でいくつかの制限があります。特に、真菌細胞壁の成分などのエンドトキシン以外の微生物産物によって活性化することもでき、かつ種々のヒト血漿タンパク質11によって阻害することができる。
過去10年間にEAの測定は循環内分血症のバイオマーカーとして開発され、検証された。LALテストと比較して、EAはより速く、臨床設定で実施するのが容易である。さらに、全血中のLALよりも正確であることが示されており、感度および特異性が増加し、インビトロおよびインビボ12の両方である。
敗血症原因体としてGN細菌を迅速に同定するための早期診断ツールとしての初期の実施にもかかわらず、EAレベルは疾患重症度のバイオマーカーとしても研究されている。この文脈において、敗血症性ショックまたは心停止症候群13などの進行中の重篤な疾患による低灌流状態を評価することが特に有用であることが示されている。より最近では、殺量化システムの開発以来、このような治療14の潜在的な候補を正確に同定するためのスクリーニングツールとして肯定的なEA結果も提案されている。我々は最近、敗血症性ショック患者107人に対して、早期高レベルのEAの有病率と臨床的意義に関する観察的振り返り研究を行った。他の最近の結果に沿って、我々はEAが敗血症性ショック15の患者における疾患重症度の有望なマーカーであることを見出した。
本原稿の目的は、ベッドサイドまたは実験室でEAアッセイを行う方法を記述し、敗血症性ショックの代表的なシナリオでその潜在的な使用を記述することです。この技術は、抗エンドトキシン抗体およびLPSの複合体によるプライミングに続く好中球における増強された酸化バーストを測定することによってLPS活性を検出することができる。増加した呼吸バーストは化学体計によって検出され、放出される光の量は血液サンプル中のエンドトキシンの量に比例すると考えられる。アッセイは、少数の試薬を必要とし、実行するのに約30分かかり、全血12の40 μL程度しか使用しなす。
Protocol
Representative Results
Discussion
敗血症性ショックは、現在でも40%と高い死亡率に関連しているが、この率は考慮されたレポート16に従って変化する。新規でより良いバイオマーカーの必要性は、早期診断、より良い管理、敗血症性ショック6の患者の予後を臨床医を支援するために、分野のほとんどの専門家によって提唱されています。
EAテストを実施する際、以前の…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は、パオロ・ブラガノとリサ・マティアセン博士に、アッセイプロトコルの方法論のレビューに感謝する。ダリオ・ウィンタートン,MDは英語能力のための原稿のレビューに大きな助けを与えました。
Materials
| EAA kit | Spectral Medical Inc. | EAAST-20 | Package with 20 tests + 1 quality control |
| Smart Line TL | Berthold | EAASL | Luminometer |
| Incubator shaker | GRANT | ES-20 | Mini-incubator shaker |
| Vortexer | VWR | 444-2790 | Vortex instrument |
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