Ensaio da atividade da endotoxina para a deteção do endotoxemia do sangue inteiro em pacientes criticamente doentes

Summary

Nós apresentamos um protocolo para medir na cabeceira a atividade da endotoxina de amostras de sangue inteiras humanas. O ensaio da atividade da endotoxina é um teste simples a executar e pode ser um biomarcador útil em pacientes criticamente doentes com sepsis.

Abstract

Lipopolissacaríno, também conhecido como endotoxina, é um componente fundamental das bactérias Gram-negativas e desempenha um papel crucial no desenvolvimento da sepse e choque séptico. A identificação adiantada de um processo infeccioso que esteja evoluindo ràpida a uma doença crítica pôde alertar um tratamento mais rápido e mais intensivo, desse modo potencial conduzindo aos melhores resultados pacientes. O ensaio da atividade da endotoxina (ea) pode ser usado na cabeceira como um biomarcador de confiança do endotoxemia sistemático. A deteção de níveis elevados da atividade da endotoxina foi mostrada repetidamente para ser associada com uma severidade aumentada da doença nos pacientes com sepsis e choque séptico. O ensaio é rápido e fácil de executar. Brevemente, após a amostragem, uma alíquota de sangue total é misturada com um anticorpo antiendotoxina e com LPS adicionado. A atividade da endotoxina é medida como a explosão oxidativa relativa de neutrófilos primados como detectado pela chemioluminescência. A saída do ensaio é expressa em uma escala de 0 (ausente) para 1 (máximo) e categorizada como “baixa” (< 0,4 unidades), "intermediário" (0,4 – 0,59 unidades), ou "alta" (≥ 0,6 unidades). A metodologia detalhada e a justificativa para a implementação do ensaio EA são relatadas neste manuscrito.

Introduction

O lipopolissacarídeo (LPS), também conhecido como endotoxina, é um componente chave da estrutura da membrana de bactérias Gram-negativas (GN). Compõe-se cerca de 10% da parede celular, sendo vital para a integridade da membrana externa e homeostase. Além disso, é um ativador potente do sistema imunológico inata do hospedeiro^1,2.

A exposição in vitro de células inatas do sistema imunológico a LPS leva a alterações na expressão de múltiplos genes³. A administração de quantidades muito pequenas de LPs em voluntários humanos saudáveis desencadeia a cascata de inflamação sistêmica aguda, enquanto a sepse e choque séptico podem surgir com maiores concentrações de endotoxina^4,5.

A sepse é uma condição de risco de vida que, se não prontamente reconhecida, pode levar a falência de múltiplos órgãos e morte. Os pacientes sépticos devem ser tratados em tempo hábil, com ressuscitação agressiva, antibioticoterapia adequada, controle de fonte ideal e estratégias de apoio a órgãos. O diagnóstico da etiologia do sepsis é baseado primeiramente no reconhecimento clínico e na deteção cultura-baseada do micróbio patogénico⁶. No entanto, os resultados das culturas microbianas podem levar até 48 h e são inconclusivos em até 30% dos casos⁷. A identificação precoce e a intervenção podem levar a melhores resultados do paciente. Em pacientes em que a sepse é suspeita, as decisões são muitas vezes feitas com base em parâmetros fisiológicos e bioquímicos, sem um sinal claro de endotoxemia.

A medição da atividade da endotoxina (EA) pode ser obtida por meio de um ensaio comercial (ver tabela de materiais) em sangue total. Pode ser utilizado como biomarcador de endotoxemia sistêmica para a estratificação precoce da severidade da doença, particularmente em pacientes com risco de desenvolver choque séptico⁸. O teste foi usado para guiar a terapia do hemoperfusion de Polymyxin B em um ensaio clínico aleatorizado-controlado duplo-cego recentemente publicado nos pacientes com choque séptico⁹. Em pacientes criticamente enfermos, o estudo do MEDIC mostrou aumento dos níveis de EA para estar associado a disfunção de múltiplos órgãos, tempo de permanência na unidade de terapia intensiva (UTI) e mortalidade¹⁰.

Diferentes ensaios foram desenvolvidos para detectar endotoxina. O ensaio Limulus Amoebocyte lysate (LAL), seja como um teste de Gel-coágulo, turbidimétrico ou cromogênico, tem sido até agora o mais freqüentemente adotado para a estimativa da endotoxina sérica. Baseia-se na capacidade de endotoxina para induzir a coagulação da hemolinfa do caranguejo em ferradura, Limulus Polyphemus. No entanto, este ensaio tem algumas limitações em termos de especificidade. Em particular, ele também pode ser ativado por produtos microbianos que não seja endotoxina, tais como componentes da parede celular fúngica, e pode ser inibida por várias proteínas plasmáticas humanas¹¹.

Durante a última década, a medida da EA foi desenvolvida e validada como um biomarcador de endotoxemia circulante. Comparado ao teste LAL, a EA é mais rápida e fácil de implementar no ambiente clínico. Além disso, demonstrou-se ser mais acurado que a LAL em sangue total, com sensibilidade e especificidade aumentadas, tanto in vitro como in vivo¹².

Apesar de sua aplicação inicial como uma ferramenta diagnóstica adiantada para a identificação rápida de bactérias do GN como agentes causais do sepsis, o nível do ea foi estudado igualmente como um biomarcador da severidade da doença. Neste contexto, demonstrou-se ser particularmente útil avaliar o estado de hipoperfusão devido à doença crítica em curso, como choque séptico ou síndrome pós-parada cardíaca¹³. Mais recentemente, desde o desenvolvimento de sistemas de hemopurificação, um resultado positivo da EA também tem sido proposto como uma ferramenta de triagem para identificar com precisão potenciais candidatos para tal terapia¹⁴. Recentemente, realizou-se um estudo observacional retrospectivo sobre a prevalência e o significado clínico dos altos níveis iniciais de EA em 107 pacientes com choque séptico. Em consonância com outros resultados recentes, verificou-se que a EA é um marcador promissor de severidade da doença em pacientes com choque séptico¹⁵.

O objetivo do presente manuscrito é descrever o método de realização do ensaio EA, seja à beira do leito ou em laboratório, e descrever seu potencial de uso em um cenário representativo de choque séptico. Esta técnica pode detectar a atividade de LPS medindo o estouro oxidativo realçado nos neutrófilos que seguem seu priming por complexos de um anticorpo da antiendotoxina e de LPS. O aumento da ruptura respiratória é detectado por um quimiluminômetro e a quantidade de luz emitida é considerada proporcional à quantidade de endotoxina na amostra de sangue. O ensaio requer poucos reagentes, leva cerca de 30 min para executar e usa tão pouco como 40 μL de sangue total¹².

Protocol

O protocolo é conduzido de acordo com as diretrizes institucionais relativas ao manuseio de bioespécimes humanos e seguindo os procedimentos operativos padrão atuais do nosso laboratório clínico. O uso de dados da EA e informações clínicas dos pacientes que estão sendo testados seguem as diretrizes do Comitê de ética em pesquisa humana da nossa instituição. 1. conteúdo do equipamento de laboratório e do kit de ensaio Guarde o kit EA a 2 – 8 ° c quando não estiver a…

Representative Results

Um homem dos anos de idade 72 foi admitido ao departamento da emergência (ED) de um hospital urbano académico. Poucos dias antes, ele tinha apresentado ao seu médico de cuidados primários reclamando de queima em micção. Uma terapia do short-curso com Fosfomicina oral foi recomendada. Sua história médica incluiu a hipertensão, o diabetes tipo-2 uncomplicated e a hiperplasia prostática benigna. Seus medicamentos incluíram Enalapril, Atorvastatina, Tamsulosin e metformina. <p …

Discussion

O choque séptico ainda hoje está associado a uma mortalidade tão alta quanto 40%, embora essa taxa varie de acordo com os relatos considerados¹⁶. A necessidade de novos e melhores biomarcadores é defendida pela maioria dos especialistas nos campos, a fim de auxiliar os clínicos no diagnóstico precoce, melhor manejo e prognosticação de pacientes com choque séptico⁶.

Realizar um teste de EA não requer conhecimento técnico prévio ou equi…

Materials

EAA kit	Spectral Medical Inc.	EAAST-20	Package with 20 tests + 1 quality control
Smart Line TL	Berthold	EAASL	Luminometer
Incubator shaker	GRANT	ES-20	Mini-incubator shaker
Vortexer	VWR	444-2790	Vortex instrument