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Genetics

प्रवेश और रिश् तों का मूल् यांकन, चींटी का उपयोग करते हुए Vollenhovia Emeryi

Published: October 5, 2018 doi: 10.3791/58521
Automatic Translation
1, 1
1Center for Bioscience Research and Education, Utsunomiya University

Summary

इस प्रोटोकॉल में, रिश् तों को पार करने के लिए तरीके, और उन की सफलता का मूल्यांकन करने के लिए, चींटी Vollenhovia emeryiके लिए वर्णित हैं । इन प्रोटोकॉल Hymenoptera में सेक्स निर्धारण प्रणालियों के आनुवंशिक आधार को समझने के उद्देश्य से प्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण हैं ।

Abstract

लिंग निर्धारण झरना के आनुवंशिक और आणविक घटक बड़े पैमाने पर मधुप, एपीआई अफ्रिकन, एक hymenopteran मॉडल जीव में अध्ययन किया गया है । हालांकि, थोड़ा सेक्स दृढ़ संकल्प अंय गैर में पाया तंत्र के बारे में जाना जाता है मॉडल hymenopteran taxa, जैसे चींटियों के रूप में । hymenopteran प्रजातियों में विकसित किए गए जीवन चक्र के जटिल स्वरूप के कारण ही प्रयोगशाला में इन जीवों के बीच प्रायोगिक क्रॉसिंगों का रखरखाव और संचालन करना मुश्किल हो जाता है । यहां, हम रिश् तों को पार करने और चींटी Vollenhovia emeryiमें उन लोगों की सफलता के मूल् यांकन के लिए तरीकों का वर्णन करते हैं । V. emeryiका उपयोग कर प्रयोगशाला में रिश् ते को प्रेरित करना, इस प्रजाति के अनूठे जीव विज्ञान की वजह से अपेक्षाकृत सरल है । विशेष रूप से, इस प्रजाति androgenetic पुरुषों का उत्पादन, और महिला उत्पादकता प्रदर्शन विंग बहुरूपता, जो आनुवंशिक पार में phenotypes की पहचान सरल । इसके अलावा, रिश् तों की सफलता का मूल् यांकन सीधा होता है जैसा कि पुरुषों के रिश् तों द्वारा लगातार उत्पादन किया जा सकता है, जबकि सामान्य नर ही क्षेत्र में एक अच्छी तरह से परिभाषित प्रजनन मौसम के दौरान दिखाई देते हैं । हमारा प्रोटोकॉल एक मॉडल के रूप में V. emeryi का उपयोग करने के लिए चींटी प्रजातियों में लिंग निर्धारण प्रणाली के आनुवंशिक और आणविक आधार की जांच के लिए अनुमति देते हैं ।

Introduction

Eusocial Hymenopteran taxa जैसे चींटियों और मधुमक्खियों ने एक haplodiploid लिंग-निर्धारण प्रणाली विकसित की है जिसमें ऐसे व्यक्ति जो एक या अधिक पूरक लिंग निर्धारण (heterozygous) CSD पर loci होते हैं, जबकि वे लोग होमो-या hemizygous बन नर (चित्रा 1A)1.

आनुवंशिक और आणविक लिंग निर्धारण झरना में शामिल घटकों को अच्छी तरह से मधुप, एपीआई अफ्रिकन, एक hymenopteran मॉडल जीव2,3,4में अध्ययन किया गया है । हाल ही में तुलनात्मक जीनोमिक्स जांच सुझाव है कि चींटियों और मधुमक्खियों सेक्स निर्धारण मार्ग में कई ख्यात homologs साझा करते हैं, जैसे प्रारंभिक सेक्स निर्धारण जीन, csd5। हालांकि, इन homologs के कार्यात्मक संरक्षण के लिए सबूत अभी भी चींटियों में कमी है ।

इस समस्या के समाधान के लिए रिश् तों को विकसित किए जाने की जरूरत है क्योंकि वे जेनेटिक मैपिंग और आणविक अध् ययन के लिए जरूरी हैं । तथापि, प्रयोगशाला में इन जीवों के बीच प्रायोगिक क्रॉसिंगों को बनाए रखना और आचरण करना कठिन है क्योंकि विकसित किए गए जीवन चक्र का जटिल स्वरूप है.

यहां, हम6,7चींटियों में सेक्स निर्धारण प्रणाली के आनुवंशिक और आणविक आधार की जांच करने के लिए एक मॉडल के रूप में Vollenhovia emeryi का उपयोग करें । इस प्रजाति की रिश् लाइनें6चींटियों में पहली बार सेक्स निर्धारण से संबंधित लक्षण के लिए मात्रात्मक विशेषता loci (QTL) की लिंकेज मैपिंग के लिए पहले विकसित की गई थीं । इसके अलावा, आणविक लिंग निर्धारण झरना7जांच की गई है । इस प्रजाति एक असामांय प्रजनन प्रणाली है कि दोनों gynogenesis और androgenesis (चित्रा 1ख)8,9रोजगार विकसित किया गया है । अधिकांश नई रानियों और पुरुषों क्लोनी क्रमशः मातृ और पैतृक जीनोम से उत्पादित कर रहे हैं । इसके अलावा, श्रमिकों और कुछ क्वींस यौन8का उत्पादन कर रहे हैं । इस प्रजनन प्रणाली विशेष रूप से अच्छी तरह से आनुवंशिक अध्ययन के लिए अनुकूल है क्योंकि रिश् तों का उपयोग कर उत्पादित पार यौन उत्पादित क्वींस और पुरुषों के आनुवंशिक रूप से एक क्लासिक backcross के बराबर हैं । के बाद से यौन उत्पादित क्वींस मातृ जीनोम10 से उत्पादित क्वींस से अलग आकृति विज्ञान (चित्रा 1ख), आचरण और रिश् तों का मूल्यांकन पार बहुत इस विधि का उपयोग कर सरलीकृत है ।

इस अनुच्छेद में, परीक्षण पार करने के लिए प्रयोगशाला कालोनियों की स्थापना के लिए तरीके, रिश् तों के आवेदन पूर्ण एसआईबी जोड़े का उपयोग कर पार, और उन की सफलता का मूल्यांकन कॉलोनी के सदस्यों और पुरुष वंश के विच्छेदन के genotyping का उपयोग कर पार जननांग V. emeryiमें वर्णित हैं ।

प्रजनन प्रणाली के बावजूद कार्यरत, रिश् तों के अनुप्रयोग Hymenoptera में सेक्स निर्धारण प्रणालियों की किसी भी जांच में अक्सर आवश्यक पहला कदम है । Cardiocondyla obscuriorमें उदाहरण के लिए, प्रयोगशाला में पूर्ण एसआईबी संभोग की 10 पीढ़ियों के बाद द्विगुणित पुरुषों की लगभग पूर्ण अनुपस्थिति CSD लोकस11के अभाव को दर्शाता है । यह रिश् तों में उत्पादित पुरुषों के अनुपात से CSD loci की संख् या की भविष्यवाणी करना संभव है6,12,13.

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Protocol

1. क्षेत्र संग्रह और प्रयोगशाला में V. Emeryi कालोनियों के रखरखाव

नोट: V. emeryi के घोंसले में पाए जाते है लॉग और जापान भर में क्षय पेड़ branchesin माध्यमिक जंगलों गिर गया । इस प्रजाति के कालोनियों के दो प्रकार, अर्थात्, (1) केवल लंबी पंखों वाली रानियों और (2) कालोनियों का उत्पादन मुख्य रूप से लंबी पंखों वाला क्वींस8,14की छोटी संख्या के अलावा लघु पंखों वाला क्वींस उत्पादन से पता चलता है । इस प्रोटोकॉल में, हम Ishikawa प्रांत, जापान में कालोनियों के उत्तरार्द्ध प्रकार एकत्र ।

  1. जल्दी गर्मियों के दौरान वी emeryi कालोनियों लीजिए ।
    नोट: प्रजनन के मौसम के दौरान यौन व्यक्तियों की पर्याप्त संख्या प्राप्त करने के लिए, ३०० से अधिक व्यक्तियों से युक्त कालोनियों को प्राथमिकता दी जाती है ।
  2. एकत्र शाखाओं से चींटी नमूनों को एक ग्लास कवर के साथ एक कृत्रिम प्लास्टर नेस्ट करने के लिए एक aspirator (चित्रा 2, बाएं) का उपयोग करके स्थानांतरित करें ।
  3. एक 16:8 एच प्रकाश के तहत 25 डिग्री सेल्सियस पर कृत्रिम घोंसले में कालोनियों बनाए रखने/ प्लास्टर गीला करने के लिए एक धोने की बोतल के साथ नल का पानी प्रदान करें ।
    1. के बारे में १०० मिलीग्राम सूखी क्रिकेट एल्यूमीनियम पंनी में लिपटे पाउडर और एक भूरे रंग की चीनी पानी से भरा टिप (20 µ एल टिप) हर दूसरे दिन जब तक नए पुनर्उत्पादकों (एफ1 पंखों वाला-क्वींस और एफ1 पुरुषों) उभरने ।

2. प्रायोगिक प्रयोगशाला पार

नोट: नई उत्पादकता देर से गर्मियों में शरद ऋतु (चित्रा 3) से उभरने के लिए शुरू करते हैं । लंबी पंखों वाली क्वींस यौन उत्पादित कर रहे हैं, और छोटे पंखों वाला क्वींस क्लोनी का उत्पादन कर रहे है और मातृ जीनोम (1 चित्रा) है । रिश् ते को पार करने के लिए लंबी पंखों वाली रानियों और पुरुषों का प्रयोग करें ।

  1. व्यक्तियों को चलती से रोकने के लिए, 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक निरंतर वातावरण कमरे में कालोनियों जगह है ।
  2. एक त्रिविम माइक्रोस्कोप के तहत संदंश का उपयोग कर 30 श्रमिकों के मध्य पैर निकालें और रिश् तों को पार करने के लिए नए छोटे प्लास्टर घोंसला (चित्रा 2, दाएं) में स्थानांतरण ।
    नोट: पैरों को उन कामगारों से उपस्थित कार्यकर्ताओं में भेद करने के लिए निकाला जाता है जो बाद में रिश् तों को पार करके उत्पादित किए जाएंगे ।
  3. 3-4 लार्वा या प्यूपा को प्लास्टर युक्त घोंसले में जोड़ें ।
    नोट: श्रमिक एफ0 क्वींस कम कॉलोनी में खोजपूर्ण गतिविधि दिखा । लार्वा या प्यूपा पार करने के दौरान कॉलोनी के केंद्र में इन श्रमिकों और नए पुनर्उत्पादकों को प्रभावी रूप से आकर्षित कर सकते हैं । नतीजतन, सामान्य कॉलोनी के करीब प्रयोगात्मक कॉलोनी की स्थितियां दुरुस्त रखें ।
  4. एक लंबे समय से पंखों वाली रानी और एक प्लास्टर में एक पुरुष का स्थानांतरण के लिए कदम २.३ में तैयार है ।
  5. एक 16:8 एच प्रकाश के तहत 25 डिग्री सेल्सियस पर कालोनियों रखें/भोजन और १.३ में वर्णित के रूप में प्रदान की पानी के साथ अंधेरे चक्र जब तक रानी उसके पंख खो और अंडे देना ।
    नोट: यह एक सप्ताह के एक महीने के लिए लेता है ।
  6. एक त्रिविम माइक्रोस्कोप के तहत प्रयोगात्मक कॉलोनी हर रोज की जाँच करें । च1 वंश के बीच रिश् ते पार करने के बाद, अंडे एक त्रिविम माइक्रोस्कोप के तहत मनाया जा सकता है ।
  7. के बाद एफ 1 रानी अंडे बिछाने शुरू होता है, एफ 1 पुरुषों और लार्वा या प्यूपा निकालने के लिए घोंसला से २.३ कदम में जोड़ा एफ1 पीढ़ी के मिश्रण से बचने के लिए (पुरुषों और महिलाओं को पार करने के लिए इस्तेमाल किया) और च2 पीढ़ी (वंश से उत्पादित रिश् ता काटता है) ।
    नोट: अगर कॉलोनी में कुछ नर हैं तो संभव है कि एक ही प्रायोगिक कॉलोनी में एक पुरुष और 1 से 3 रानियों का प्रयोग करते हुए रिश् ते को पार करने के लिए प्रेरित किया जाए ।
  8. एक ही conditionsas १.३ में वर्णित के तहत कालोनियों रखें, F2 वंश उभरने तक ।
    नोट: स्थानांतरण एफ1 रानी और एफ2 वंश में नए बड़े प्लास्टर घोंसला (चित्रा 2, बाएं) लंबे समय तक कॉलोनी रखने के लिए ।

3. रिश् तों की सफलता का मूल् यांकन

  1. डीएनए निष्कर्षण और पैतृक पीढ़ी के genotyping (एफ0)
    1. संदंश का उपयोग कर एक एफ0 रानी के एक पैर निकालें और केलेशनथेरेपी एजेंट के १०० µ एल युक्त एक १.५ मिलीलीटर microtube के लिए पैर हस्तांतरण ।
    2. एक त्रिविम माइक्रोस्कोप के तहत, ग्लास डिश में एक महिला के पेट काटना संदंश का उपयोग कर ultrapure पानी की ३०० µ एल से भरा है और spermatheca से युक्त शुक्राणु पुरुषों को अलग ।
    3. दूर spermatheca के ऊतकों छील और कीट पिन का उपयोग कर महिला के ऊतकों से शुक्राणु को अलग ।
      नोट: spermatheca से शुक्राणु निष्कर्षण की सुविधा के लिए, एक से अधिक दिन के लिए १००% ेतोः में महिला नमूनों की दुकान विच्छेदन से पहले ।
    4. एक micropipette का प्रयोग, एक १.५ मिलीलीटर केलेशनथेरेपी एजेंट के १०० µ एल युक्त microtube में शुक्राणु हस्तांतरण ।
    5. एफ0 रानी और 3.1.1 और 3.1.3 कदम में तैयार शुक्राणुओं की मशीन, क्रमशः 20 मिनट के लिए ९५ डिग्री सेल्सियस पर, 4 डिग्री सेल्सियस पर microtube और स्टोर केंद्रापसारक ।
    6. जीनोटाइप विधि का उपयोग कर सभी नमूनों को कहीं और वर्णित4.
  2. डीएनए निष्कर्षण के लिए इस्तेमाल किया चींटियों की जोड़ी से पार (एफ1)
    1. एसआईबी द्वारा अंडे उत्पादन की पुष्टि के बाद एफ1 रानी, उसके बहाने पंख या एक मध्य पैर और जीनोटाइप का उपयोग कर एक ही विधि का उपयोग कर रानी के डीएनए निकालने के ऊपर धारा ३.१ में वर्णित है ।
    2. एक पैर का उपयोग कर एफ1 पुरुष के डीएनए निकालें और जीनोटाइप उंहें एक ही विधि का उपयोग कर ऊपर धारा ३.१ में वर्णित है ।
      नोट: नमूने डीएनए निष्कर्षण से पहले १००% ेतोः में संग्रहित किया जा सकता है, और केलेशनथेरेपी एजेंट में डीएनए 4 डिग्री सेल्सियस पर दो महीने के लिए संग्रहित किया जा सकता है ।
  3. रिश् तों से उत्पादित पुरुषों में पुरुष प्रजनन क्षमता का मूल्यांकन
    नोट: इस रिश् तों से उत्पादित द्विगुणित नर प्रायः बाँझ होते हैं.
    1. काटना के ४०० µ एल के साथ एक ग्लास डिश में आंतरिक प्रजनन अंगों संदंश का उपयोग कर समाधान ।
    2. पंजाबियों को हटाने और एक micropipette का उपयोग कर 4% paraformaldehyde (पीएफए) जोड़ें ।
    3. कमरे के तापमान (15-25 डिग्री सेल्सियस) पर 30 मिनट के लिए पीएफए में गर्मी के ऊतकों को ठीक करें ।
    4. धो ऊतक एक micropipette का उपयोग कर पंजाब के ४०० µ एल के साथ 5 बार ।
    5. पतला 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) समाधान के लिए 1 µ g/
    6. पंजाबियों निकालें और ऊतक के लिए इस पतला DAPI धुंधला समाधान के लगभग ३०० µ एल जोड़ें ।
    7. कमरे के तापमान (15-25 डिग्री सेल्सियस) पर अंधेरे हालत के तहत 15 मिनट की मशीन ।
    8. धो ऊतक पंजाब के ४०० µ एल के साथ 5 बार, और स्लाइड ग्लास के केंद्र पर स्थानांतरण ऊतक संदंश का उपयोग कर ।
    9. माउंट Tetramethylrhodamine युक्त मध्यम पर ऊतक (TRITC)-संयुग्मित phalloidin.
    10. 20X या 63X उद्देश्य लेंस का उपयोग कर फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप द्वारा नमूनों का निरीक्षण ।
    11. DAPI का पता लगाने के लिए एक ४०५ एनएम उत्तेजना लेजर और 410-530 एनएम पर एक संकर डिटेक्टर का प्रयोग करें ।
    12. TRITC का पता लगाने के लिए एक ५६१ एनएम उत्तेजना लेजर और 565-650 एनएम पर एक संकर डिटेक्टर का प्रयोग करें ।
    13. ४०० हर्ट्ज (४०० लाइनों/s) के एक संकल्प पर १०२४ × १०२४ पिक्सल में एक स्कैन की गति का उपयोग करें ।
    14. एक सॉफ्टवेयर मंच का उपयोग छवियों पर कब्जा ।

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Representative Results

एफ0 और एफ1 पीढ़ियों का उपयोग कर माइक्रोसेटेलाइट विश्लेषण के परिणाम से पता चला कि रिश् तों को सफलतापूर्वक (चित्रा 4)6का उत्पादन किया गया पार । रिश् तों का एक परिणाम के रूप में, साथी क्वींस प्रयोगात्मक पार कालोनियों की स्थापना के एक महीने के भीतर प्राप्त किया गया । सभी वंश का एक चौथाई (२७.१ ± ८.९१% एसडी) (F2) रिश् ते से पार करता हुआ पुरुष था, जबकि कुद महिला (कामगार और एक रानी)6थी । QTL मानचित्रण से वंश का उपयोग करते हुए पता चला है कि रिश् ते को पार कर रहे पुरुषों का उत्पादन द्विगुणित और homozygous पर दो CSD loci (CSD1 और CSD2 चित्रा 5में) थे, जबकि मादा (मजदूर) से उत्पादित रिश् ता पार द्विगुणित थे और heterozygous एक CSD लोकस6से कम ।

अगुणित नर का विच्छेदन परीक्षण और शुक्राणु का पता चला, के रूप में की उंमीद (चित्रा 6A-6C) । हालांकि, द्विगुणित पुरुषों में, शुक्राणुओं कभी नहीं देखा गया था, सुझाव है कि पुरुषों के रिश् तों में उत्पादित V emeryi6 में बाँझ हैं. इसके अलावा, द्विगुणित पुरुषों के testes विकसित करने में विफल (चित्रा 6D-6E) ।

Figure 1
चित्रा 1 . (क) Hymenoptera और असामान्य प्रजनन प्रणाली में androgenesis और gynogenesis शामिल (ख) वि. emeryiमें ठेठ प्रजनन प्रणाली . आमतौर पर, महिलाओं (श्रमिकों और क्वींस) निषेचित द्विगुणित अंडे से विकसित करने, और पुरुषों को निषेचित अगुणित मातृ जीनोम (ए) के आधे से युक्त अंडे से विकसित करना । V. emeryiमें, बाँझ श्रमिकों और कुछ लंबे समय से पंखों वाला क्वींस (LWQ) निषेचित द्विगुणित अंडे से विकसित है, जबकि कम पंखों वाला क्वींस (SWQ) लगभग पूर्ण निषेचित द्विगुणित अंडे (gynogenesis) से मातृ जीनोम के साथ विकसित करना । पुरुषों मातृ जीनोम कभी वारिस लेकिन उनके पिता (androgenesis) (ख) के क्लोन हैं । यह आंकड़ा [Miyakawa et al. २०१८]7से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 . वी. emeryi कालोनियों की प्रायोगिक स्थापना । क्षेत्र संग्रह के बाद, कालोनियों एक कृत्रिम प्लास्टर घोंसले में स्थानांतरित कर रहे है और प्रयोगशाला में रखा । एक बड़े प्लास्टर घोंसला (बाएं) एकत्र कालोनियों बनाए रखने के लिए तैयार है, जबकि एक छोटे प्लास्टर घोंसला (सही) प्रयोगात्मक रिश् तों के लिए तैयार है पार । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 . नई V. emeryi उत्पादकता प्रजनन के मौसम के दौरान उभरने । परिपक्व और अच्छी तरह से fedcolonies छोटे पंखों वाला क्वींस (SWQ) जो केवल मातृ जीनोम (आंकड़ा 1ख) भालू के अलावा पैतृक जीनोम के साथ लंबी पंखों वाली क्वींस (LWQ) का उत्पादन करते हैं । श्री टाकू Shimada की फोटो साभार. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 . रिश् ते को पार करता है और f0 और f1 पीढ़ियों के माइक्रोसेटेलाइट पादी का डिजाइन । 11 माइक्रोसेटेलाइट मार्करों का प्रयोग पिछले अध्ययन में विकसित6,8,9, महिलाओं और पैतृक पीढ़ी के पुरुषों (एफ0) अलग पादी दिखाया. पादी के लिए इस्तेमाल किया महिलाओं और पुरुषों के प्रयोगात्मक पार (एफ1) पैतृक और पैतृक पादी विरासत में मिला, क्रमशः, यह दर्शाता है कि महिलाओं को सफलतापूर्वक अपने भाइयों के साथ पार कर रहे थे, जिसके साथ महिलाओं को साझा उनके आधे जीनोम. नंबर माइक्रोसेटेलाइट लोकस एल-5में पीसीआर उत्पादों की लंबाई का संकेत है, जो genotyping6,8,9,10के लिए इस्तेमाल मार्करों में से एक है । यह आंकड़ा [Miyakawa और Mikheyev २०१५]6से डेटा के अनुसार सचित्र किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5 . रिश् तों द्वारा उत्पादित वंश में दो CSD loci (CSD1 और CSD2) के एलील पैटर्न को पार करता है । द्विगुणित पुरुषों के अनुपात (के बारे में 25%) और QTL मानचित्रण एसआईबी द्वारा उत्पादित वंश का उपयोग कर-मेट क्वींस V. emeryiमें दो CSD loci के अस्तित्व का सुझाव । मादाएं दो CSD loci में से कम में heterozygous होती हैं, जबकि नर सभी loci में homozygous होते हैं । पादी वर्णमाला के अक्षरों द्वारा प्रतिनिधित्व कर रहे हैं । यह आंकड़ा [Miyakawa et al. २०१८]7से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6 . V. emeryiमें androgenetic अगुणित और द्विगुणित नर के पुरुष आंतरिक जनन अंगों को . androgenetic अगुणित नर (क) से Morphologies और अंय आंतरिक जनन अंगों का परीक्षण । शुक्राणु (रेशेदार ऊतक) अगुणित पुरुषों (बी और सी) के परीक्षण में देखा जा सकता है । नीले रंग के निशान DAPI द्वारा दाग नाभिक, और लाल रंग के निशान F-actin दाग Tetramethylrhodamine (TRITC) द्वारा-संयुग्मित phalloidin बी, सी, और ई. (a) गौण ग्रंथियों; (t) tests; (v) वॉज deferens; (छ) बाहरी जननांग । आंतरिक जनन अंगों का Morphologies द्विगुणित नर (घ) से निकला । परीक्षण और द्विगुणित पुरुषों के शुक्राणु देखा कभी नहीं थे (डी और ई, एन > > 30) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

यह लेख प्रोटोकॉल है कि रिश् ते को प्रेरित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है प्रदर्शित करता है और V. emeryiचींटी में रिश् तों की घटना का मूल्यांकन । प्रयोगों में, रेडक्रास के लिए उपयोग किए जाने वाले व्यक्तियों की genotyping यह सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है कि रिश् ते को पार करना सफल रहे । हालांकि, इन पार परीक्षणों की प्रभावशीलता स्पष्ट रूप से द्विगुणित पुरुषों साल भर में उत्पादन किया जा सकता है के रूप में स्पष्ट है, जबकि अगुणित नर केवल शरद ऋतु में दोनों क्षेत्र और प्रयोगशाला6में उत्पादित किया जा सकता है । एसआईबी-मेट क्वींस पार करने के बाद तुरंत पुरुष वंश का उत्पादन शुरू करते हैं । V. emeryi6,7 में द्विगुणित और अगुणित नर के बीच सं रूपात्मक phenotypic मतभेद मनाया गया । तथापि, द्विगुणित पुरुष V. emeryi लगभग हमेशा परीक्षण विकसित करने के लिए असफल । परीक्षणों को पार करने के लिए इस्तेमाल जोड़े के आनुवंशिक संबंधित के परीक्षण के लिए आनुवंशिक मार्कर के अभाव में, पुरुष वंश की प्रजनन क्षमता का अनुमान है कि क्या रिश् ता हुआ है करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि रिश् तों में उत्पादित नर अन्य hymenopteran प्रजातियों15,16,17में हमेशा बाँझ नहीं होते हैं ।

प्रोटोकॉल की सफलता में पहला महत्वपूर्ण कदम अच्छी तरह से खिलाया कालोनियों के रखरखाव है, के रूप में उंहें क्षेत्र संग्रह के बाद खिलाने के पार के लिए पर्याप्त संख्या में प्राप्त करने की संभावना में वृद्धि होगी । V. emeryiमें पोषण और लंबी पंखों वाली रानियों के उत्पादन के बीच एक सकारात्मक संबंध बताया गया है, जो कि10पार के रिश् तों के लिए उपयोग की जाने वाली रानियां हैं । सामाजिक कीड़ों में, छोटी कालोनियों, या गरीब स्वास्थ्य में कालोनियों, नए उत्पादक18उत्पादन नहीं करते हैं । इसलिए क्षेत्र से परिपक्व कालोनियों को इकट्ठा करना और नए पुनर्उत्पादकों का उपयोग करने के लिए उन्हें पर्याप्त मात्रा में पौष्टिक भोजन उपलब्ध कराना महत्वपूर्ण है ।

दूसरे महत्वपूर्ण कदम के लिए श्रमिकों, प्रजनन और कुछ लार्वा या प्यूपा पार परीक्षण के दौरान एक साथ रखने के लिए और एक सामांय कॉलोनी के रूप में एक ही राज्य में प्रयोगात्मक पार कॉलोनी बनाए रखना है जब तक पार (एक महीने के लिए एक सप्ताह के लिए) पूरा हो गया है । यह कालोनियों है कि अधिक से अधिक 3 दिनों के लिए श्रमिकों के बिना परीक्षण पार के लिए इस्तेमाल किया जा रहे है बनाए रखने के लिए मुश्किल है क्योंकि पुरुषों को खुद को खिलाने में असमर्थ है और श्रमिकों से तंग आ जाना चाहिए । ऐसी अप्राकृतिक स्थितियों के तहत रिश् तों की सफलता की दर बेहद कम6थी ।

वहां दो अंय चींटी प्रजातियों के लिए इन प्रोटोकॉल के आवेदन के बारे में सीमाएं हैं । सबसे पहले, पार उत्प्रेरण के लिए cues प्रजातियों विशिष्ट हैं । यह अपेक्षाकृत आसान है emeryi में प्रयोगशाला पार के बाद से अंतर कॉलोनी संभोग उड़ान के बिना प्रकृति में होता है । हालांकि, कई चींटी प्रजातियों संभोग अनुष्ठान है कि मंगल उड़ानों के दौरान जो नए क्वींस और पुरुषों मेट के दौरान या19उड़ान के बाद शामिल विकसित किया है । इसलिए यह है कि एक प्रयोगशाला की स्थापना में प्रत्येक प्रजाति में पार प्रेरित ट्रिगर स्पष्ट करने के लिए महत्वपूर्ण है । उदाहरण के लिए, परजीवी चींटी Acromyrmex ameliaeमें, मंगल उड़ानों को ट्रिगर करने के लिए मुख्य उत्तेजना प्रकाश20प्रतीत होता है । दूसरी सीमा है, कुछ मामलों में, के रूप में वे काम नहीं कर रहे है और/या कम प्रजनन क्षमता नहीं है, और इस प्रकार की कालोनी के लिए एक प्रमुख लागत कर रहे है के रूप में वे कर रहे है और/ उद्देश्य प्रजातियों21,22,23। सौभाग्य से, द्विगुणित V. emeryi पुरुषों श्रमिकों द्वारा मारे नहीं है और वे रहते है जब तक वे स्वाभाविक रूप से मर जाते हैं, जो पता चलता है कि वे अक्सर प्रकृति में सामना नहीं कर रहे है और एक रणनीति है कि कालोनियों से द्विगुणित पुरुषों को बाहर नहीं इस प्रजाति में विकसित नहीं किया है ।

अंय चींटी प्रजातियों कि arrhenotokous अनिषेकजनन को पुन: पेश करने के लिए रोजगार की तुलना में (चित्रा 1ए), हम मान सकते है कि प्रयोगात्मक रिश् ते के उत्पादन के लिए कुछ लाभ कर रहे है के रूप में androgenesis द्वारा V. emeryi का उपयोग कर पार रिश् ते को पार करता है आनुवंशिक रूप से एक क्लासिक backcross के बराबर हैं । दरअसल, प्रणाली हमें सेक्स संकल्प जीन, आणविक तंत्र की जांच करने के लिए प्रयोग डिजाइन करने के लिए सक्षम है, और इस प्रजाति6,7में कार्यात्मक अध्ययन करते हैं ।

संक्षेप में, रिश् ते को पार करने के तरीके और परिणामी क्रॉसिंग की सफलता का मूल्यांकन करने के लिए वि. emeryiमें बताए गए हैं । इन प्रोटोकॉल Hymenoptera में सेक्स निर्धारण प्रणालियों के आनुवंशिक और आणविक आधार को समझने में निर्देशित प्रयोगों के लिए आवश्यक हैं ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम श्री टाकू Shimada, AntRoom, टोक्यो, जापान के प्रतिनिधि, हमें वी. emeryi पुनर्उत्पादकों की उनकी तस्वीर के साथ प्रदान करने के लिए धंयवाद । इस परियोजना के युवा वैज्ञानिकों (16J00011) के लिए विज्ञान (JSPS) अनुसंधान फैलोशिप के संवर्धन के लिए जापान सोसायटी द्वारा वित्त पोषित किया गया था, और युवा वैज्ञानिकों (ख) (16K18626) के लिए सहायता में अनुदान ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Plaster powder N/A N/A Any brand can be used
Charcoal, Activated, Powder Wako 033-02117,037-02115
Slide glass N/A N/A Any brand can be used
Dry Cricket diet N/A N/A Any brand can be used
Brown shuger  N/A N/A Any brand can be used
Styrene Square-Shaped Case AS ONE Any size Size varies by number of ants
Incbator Any brand can be used
Aluminum block bath Dry thermo unit DTU-1B TAITEC 0014035-000
1.5mL Hyper Microtube,Clear, Round bottom WATSON 131-715CS
Ethanol (99.5) Wako 054-07225
Stereoscopic microscope N/A N/A Any brand can be used
Forseps DUMONT 0108-5-PO
Chelex 100 sodium form SIGMA 11139-85-8
Phosphate Buffer Saline (PBS) Tablets, pH7.4 TaKaRa T9181
Paraformaldehyde Wako 162-16065
-Cellstain- DAPI solution Dojindo Molecular Technologies D523
ABI 3100xl Genetic Analyzer Applied Biosystems Directly contact the constructor formore informations.
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References

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जेनेटिक्स अंक १४० रिश् पार Hymenoptera Vollenhovia emeryi लिंग निर्धारण प्रणाली द्विगुणित नर पूरक सेक्स निर्धारक
प्रवेश और रिश् तों का मूल् यांकन, चींटी का उपयोग करते हुए <em>Vollenhovia Emeryi</em>
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Miyakawa, M. O., Miyakawa, H.… More

Miyakawa, M. O., Miyakawa, H. Induction and Evaluation of Inbreeding Crosses Using the Ant, Vollenhovia Emeryi. J. Vis. Exp. (140), e58521, doi:10.3791/58521 (2018).

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