Summary
En este protocolo, se describen métodos para la realización de cruzamientos de consanguinidad y para evaluar el éxito de esas cruces, de la hormiga Vollenhovia emeryi. Estos protocolos son importantes para experimentos para entender la base genética de los sistemas de determinación de sexo en himenópteros.
Abstract
Los componentes genéticos y moleculares de la cascada de determinación sexual se han estudiado ampliamente en la abeja, mellifera de APIs, un organismo modelo de himenópteros. Sin embargo, poco se sabe sobre los mecanismos de determinación del sexo encontrados otros taxones de modelo no himenópteros, como las hormigas. Debido a la naturaleza compleja de los ciclos de vida que han evolucionado en especies de himenópteros, es difícil de mantener y realizar cruces experimentales entre estos organismos en el laboratorio. Aquí, describimos los métodos para la realización de cruzamientos de consanguinidad y para evaluar el éxito de esas cruces en ant Vollenhovia emeryi. Inducir la endogamia en el laboratorio con c. emeryi, es relativamente sencillo debido a la singular biología de las especies. Específicamente, esta especie produce machos androgenética y reproductores femeninos exhiben polimorfismo de ala, que simplifica la identificación de los fenotipos en cruces genéticos. Además, evaluar el éxito de la endogamia es sencilla como los varones pueden ser producidos continuamente por endogamia cruces, mientras que los varones normales aparecen sólo durante una estación reproductiva bien definida en el campo. Nuestro protocolo permiten utilizar V. emeryi como modelo para investigar las bases genéticas y moleculares del sistema de determinación sexual en especies de hormigas.
Introduction
Taxa de himenóptero eusociales, como las hormigas y las abejas, han desarrollado un sistema de sexo-determinación de haplodiploid en que los individuos son heterocigotos en la determinación del sexo complementario uno o más loci (CSD) se convierten en hembras, mientras que los que son homo - o hemizygous se convierten en los varones (figura 1A)1.
Componentes genéticos y moleculares implicados en la cascada de determinación sexual han sido bien estudiados en la abeja, Apis mellifera, modelo himenópteros organismo2,3,4. Genómica comparativa las investigaciones recientes sugieren que las hormigas y las abejas comparten muchos homólogos putativos en el camino de la determinación del sexo, como el gen de determinación inicial del sexo, csd5. Sin embargo, evidencia para la conservación funcional de estos homólogos todavía carece de las hormigas.
Para resolver este problema, las líneas de la endogamia necesitan ser desarrollados como son esenciales para la Cartografía genética y estudios moleculares. Sin embargo, es difícil de mantener y realizar cruces experimentales entre estos organismos en el laboratorio debido a la naturaleza compleja de los ciclos de vida que han evolucionado.
Aquí, utilizamos Vollenhovia emeryi como modelo para investigar las bases genéticas y moleculares del sistema de determinación de sexo en las hormigas6,7. Las líneas de la endogamia de esta especie fueron desarrolladas previamente para el mapeo de ligamiento de loci de rasgos cuantitativos (QTL) para características relacionadas con la determinación del sexo por primera vez en6de las hormigas. Además, la cascada de determinación molecular del sexo ha sido investigado7. Esta especie ha desarrollado un sistema de reproducción inusual que emplea la ginogénesis y androgénesis (figura 1B)8,9. Mayoría de nuevas reinas y los machos se producen clonalmente de los genomas maternos y paternos, respectivamente. Además, los trabajadores y algunas reinas se producen sexualmente8. Este sistema de reproducción es particularmente idóneo para estudios genéticos porque las cruces de consanguinidad producidas utilizando sexualmente producen a reinas y machos son genéticamente equivalentes a un retrocruzamiento clásico. Puesto que el queens sexual producidas difieren morfológicamente de reinas producidas a partir de genomas materno10 (figura 1B), realización y evaluación de cruzamientos de consanguinidad se simplifican muchísimo usando este método.
En este artículo, los métodos para el establecimiento de colonias de laboratorio para la prueba de paso, aplicación de endogamia cruza usando pares de hermanos completos y evaluar el éxito de esas cruces mediante Genotipado de los miembros de la Colonia y la disección de la descendencia masculina los órganos genitales se describen en V. emeryi.
Independientemente del sistema de reproducción empleado, aplicación de cruces por endogamia es a menudo el primer paso esencial en cualquier investigación de sistemas de determinación de sexo en los himenópteros. Por ejemplo en Cardiocondyla obscurior, la ausencia casi absoluta de machos diploides después de 10 generaciones de hermanos completos en el laboratorio demuestra ausencia de CSD locus11. Es posible predecir el número de loci CSD de la proporción de machos producidos en endogamia cruces6,12,13.
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Protocol
1. colección y mantenimiento de las colonias de V. Emeryi en el laboratorio de campo
Nota: Nidos de V. emeryi se encuentran en la descomposición de troncos y caídos que se decae árbol branchesin bosques secundarios en todo el país. Esta especie muestra dos tipos de colonias, es decir, (1) colonias produciendo sólo reinas de alas largas y (2) colonias principalmente la producción de reinas con alas cortas además de pequeño número de reinas alas largas8,14. En este protocolo, hemos recogido este último tipo de colonias en la Prefectura de Ishikawa, Japón.
- Recopilar V. emeryi colonias durante principios del verano.
Nota: Para obtener un número suficiente de individuos sexuales durante la estación reproductiva, las colonias que contienen a más de 300 personas se prefieren. - Transferir a las muestras y de las ramas recogidas a un nido artificial de yeso con una cubierta de vidrio utilizando un aspirador (figura 2, izquierda).
- Mantener colonias en el nido artificial a 25 ° C en un ciclo de 16:8 h luz/oscuridad. Proporciona agua con una botella de lavado para mojar el yeso.
- Añadir unos 100 mg de polvo de cricket seco envuelto en papel de aluminio y una azúcar marrón lleno de agua punta (20 μl) cada dos días hasta que surgen nuevos reproductores (F1 alado-reinas y machos de1 F).
2. experimental laboratorio cruces
Nota: Nuevos reproductores comienzan a surgir desde finales del verano hasta el otoño (figura 3). Reinas de alas largas se producen sexualmente, y corto de alas reinas son producidas clonalmente y el genoma materno (figura 1). Utilizar machos y reinas alas largas para cruces de consanguinidad.
- Para detener a individuos de mover, colocar colonias en una sala de ambiente constante a 4 ° C durante 15 minutos.
- Quitar las patas de mediados de los 30 trabajadores con unas pinzas en un microscopio estereoscópico y transferirlas en nuevo nido menor de yeso (figura 2, derecha) para cruces de consanguinidad.
Nota: Las piernas se quitan para distinguir a los trabajadores actuales de los trabajadores que serán producidos por las endogamia posteriores cruces. - Añadir 3-4 larvas o pupas en un nido de yeso con los trabajadores.
Nota: Los trabajadores muestran actividad exploratoria en la colonia de reinas menos F0 . Larvas o pupas pueden efectivamente atraer a estos trabajadores y nuevos reproductores en el centro de la colonia durante la prueba de la travesía. En consecuencia, mantener las condiciones de la Colonia experimental cerca de la Colonia normal. - Transferencia de una reina de alas largas y un hombre en un nido de yeso preparado en el paso 2.3 para cruces de consanguinidad.
- Mantener las colonias a 25 ° C en un ciclo de 16:8 h luz/oscuridad con comida y agua como se describe en 1.3, hasta que la reina pierde sus alas y ponen huevos.
Nota: Esto lleva una semana a un mes. - Compruebe la vida cotidiana de la Colonia experimental en un microscopio estereoscópico. Después de realizar la endogamia cruza entre la descendencia de1 F, huevos se observan bajo un microscopio estereoscópico.
- Después de la F1 Reina empieza a poner huevos, quitar los machos de1 F y larvas o pupas agregados en el paso 2.3 del nido para evitar la mezcla de la F1 generación (machos y hembras utilizadas para cruces de consanguinidad) y la F2 (descendencia producido a partir de cruzamientos de consanguinidad).
Nota: Si hay pocos hombres en la Colonia, es posible inducir la endogamia cruces con un macho y 1 a 3 reinas en la Colonia experimental misma. - Mantener las colonias bajo el mismo conditionsas que se describe en 1.3, hasta que salen crías de2 F.
Nota: Reina de transferencia F1 y F2 crías en nuevo nido de yeso más grande (figura 2, izquierda) para el mantenimiento a largo plazo de la Colonia.
3. evaluación del éxito de la endogamia
- Extracción de ADN y genotipado de la generación parental (F0)
- Quite una pierna de una reina de0 F con unas pinzas y transferir la pierna a un microtubo de 1.5 mL que contienen 100 μl del agente quelante.
- En un microscopio estereoscópico, diseccionar un abdomen femenino en plato de vidrio con 300 μL de agua ultrapura con unas pinzas y aislar la espermateca que contiene los espermatozoides de los hombres acoplados.
- Retire el tejido de la espermateca y aislar los espermatozoides del tejido de la hembra usando pernos de insectos.
Nota: Para facilitar la extracción de espermatozoides de la espermateca, almacenar especímenes hembra 100% EtOH por más de un día antes de la disección. - Usando una micropipeta, transferir la esperma en un microtubo de 1.5 mL que contienen 100 μl del agente quelante.
- Incubar muestras de F0 Reina y espermatozoides preparados en el paso 3.1.1 y 3.1.3, respectivamente, a 95 ° C durante 20 min Flash el microtubo de centrífuga y almacenar a 4 ° C.
- Genotipo de todas las muestras utilizando el método descrito en otra parte4.
- Extracción de ADN de la pareja de hormigas utilizadas para cruces de endogamia (F1)
- Después de confirmar la producción de huevos por el sib había acoplado a reina de F1 , extraer el ADN de la reina con sus alas de cobertizo o una pierna medio y genotipo utilizando el mismo método descrito en la sección 3.1 anterior.
- Extracto de hombre1 de ADN de F usando una pierna y genotipo utilizando el mismo método descrito en la sección 3.1 anterior.
Nota: Las muestras pueden almacenarse en un 100% EtOH antes de la extracción de ADN y ADN en agente de quelación pueden almacenarse durante dos meses a 4 ° C.
- Evaluación de la fertilidad masculina en varones procedentes de cruces de consanguinidad
Nota: Los machos diploides producidos de cruzamientos de consanguinidad son a menudo estériles.- Disecar los órganos reproductivos internos en un plato de cristal con 400 μL de solución de PBS con unas pinzas.
- Retirar el PBS y añadir 4% paraformaldehido (PFA) utilizando una micropipeta.
- Fijar el tejido en PFA de incubación durante 30 min a temperatura ambiente (15-25 ° C).
- Lavar el tejido 5 veces con 400 μL de PBS utilizando una micropipeta.
- Diluir el 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) solución a 1 μg/mL en PBS.
- PBS de quitar y añadir aproximadamente 300 μL de esta solución de tinción DAPI diluida al tejido.
- Incubar 15 min bajo condición de oscuro a temperatura ambiente (15-25 ° C).
- Lavar el tejido 5 veces con 400 μL de PBS y transferencia de tejido en el centro del vidrio portaobjetos con unas pinzas.
- Montar el tejido en medio que contienen conjugado Tetramethylrhodamine TRITC phalloidin de montaje.
- Observar las muestras por láser confocal de barrido microscopio usando lentes de objetivo de 63 X o 20 X.
- Utilizando un láser de excitación 405 nm y un detector híbrido entre 410-530 nm para la detección de DAPI.
- Para la detección de TRITC utilice un láser de excitación 561 nm y un detector híbrido a 565-650 nm.
- Utilice una velocidad de barrido de 400Hz (400 líneas/s) con una resolución de 1024 × 1024 Pixeles.
- Captura de imágenes utilizando una plataforma de software.
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Representative Results
Los resultados de análisis de microsatélites usando F0 y F1 generaciones demostraron que cruces de consanguinidad fueron producidos con éxito (figura 4)6. Como resultado de cruces de consanguinidad, acopladas queens se obtuvieron dentro de un mes del establecimiento de las colonias de travesía experimental. Un cuarto (27,1 ± SD de 8.91%) de toda descendencia (F2) de los cruzamientos de consanguinidad era masculino, mientras que el resto era mujer (trabajadores y una reina)6. Mapeo de QTL mediante la descendencia de cruzamientos de consanguinidad demostró que los machos producidos por endogamia cruces eran diploides y homocigótico en dos CDs loci (CSD1 y CSD2 en la figura 5), mientras que las hembras (trabajadores) producidos a partir de cruzamientos de consanguinidad fueron diploides y heterozigótica en menos de un CSD del lugar6.
Disección de machos haploides reveló los testículos y los espermatozoides, como esperado (figura 6A-6 C). Sin embargo, en los machos diploides, espermas nunca se observaron, sugiriendo que los machos producidos en cruces de consanguinidad son estériles en V. emeryi6. Además, los testículos de los machos diploides no se pudo desarrollar (figura 6-6E).
Figura 1 . Sistema reproductivo típico en himenópteros (A) y el sistema reproductivo anormal que implica androgénesis y ginogénesis en (B) V. emeryi. Típicamente, hembras (trabajadores y reinas) se desarrollan de huevos fertilizados diploides y los machos desarrollan a partir de óvulos no fecundados haploides con la mitad del genoma materno (A). En V. emeryi, trabajadores estériles y algunas reinas de alas largas (LWQ) desarrollan de huevos fertilizados diploides, mientras que corta alas reinas (SWQ) desarrollan con genomas maternos casi completas de huevos no fertilizados diploides (ginogénesis). Los varones no heredan nunca genomas maternos pero son clones de sus padres (androgénesis) (B). Esta figura ha sido modificada desde [Miyakawa et al 2018]7. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 . Montaje experimental de colonias V. emeryi . Después de la recolección de campo, colonias son transferidas en un nido artificial de yeso y mantenidas en el laboratorio. Un nido de yeso grande (izquierda) se prepara para mantener colonias recogidas, mientras que un pequeño nido de yeso (derecha) está preparado para cruces de consanguinidad experimental. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 . Nueva V. emeryi reproductores emergen durante la estación reproductiva. Maduras y bien fedcolonies tienden a producir a reinas de alas largas (LWQ) con el genoma parental además de reinas con alas cortas (SWQ) que llevan sólo el genoma materno (figura 1B). Foto cortesía de Sr. Taku Shimada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 . Diseño de cruces de endogamia y genotipos microsatélites de F0 y F1 generaciones. Uso de marcadores microsatélites 11 desarrollado en anteriores estudios6,8,9, hembras y machos de la generación parental (F0) mostraron diferentes genotipos. Los genotipos de hembras y machos usados para cruzas experimentales (F1) heredaron los genotipos parentales y paternales, respectivamente, indicando que las mujeres se cruzaron con éxito con sus hermanos, con la cual las hembras comparten la mitad su genomas. Números indican las longitudes de los productos PCR en locus microsatélites L-5, que es uno de los marcadores utilizados para genotipificación6,8,9,10. Esta figura ha sido ilustrada según los datos de [Miyakawa y Mikheyev 2015]6. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5 . Patrones de alelos de dos loci CSD (CSD1 y CSD2) en la descendencia producción por endogamia cruces. Proporción de machos diploides (alrededor del 25%) y mapeo de QTL con descendencia producido por sib-acoplado queens sugieren la existencia de dos lugares geométricos CSD en V. emeryi. Las hembras son heterocigotos en al menos uno de los dos loci de CDs mientras que los machos son homocigóticos en todos los loci. Genotipos se representan por letras del alfabeto. Esta figura ha sido modificada desde [Miyakawa et al 2018]7. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6 . Órganos reproductores internos masculinos de androgenética machos haploides y diploides en V. emeryi. Morfologías de los testículos y otros órganos reproductores internos se disecaron de los androgenética haploides machos (A). Esperma (tejido fibroso) se podía ver en los testículos de los machos haploides (B y C). Color azul marca núcleos manchados por DAPI, y marcas de color rojo F-actina mancharon por phalloidin conjugado TRITC Tetramethylrhodamine en B, C y E. (a) glándulas accesorias; (t) testículos; (v) conducto deferente; (g) genitales externos. Morfología de los órganos reproductivos internos se diseca de los machos diploides (D). Nunca se observaron los testículos y el esperma de machos diploides (D y E, N >> 30). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este artículo muestra los protocolos que pueden utilizarse para inducir la endogamia cruces y evaluar la ocurrencia de la endogamia en la ant V. emeryi. En los experimentos, pruebas de genotipo de los individuos utilizados para cruces es necesario para asegurarse de que la endogamia cruces tuvieron éxito. Sin embargo, la efectividad de estas pruebas de cruce es claramente evidente como pueden producir machos diploides durante todo el año, mientras que los machos haploides se pueden producir solamente en otoño en el campo y el laboratorio6. Sib-acoplado queens comienzan a producir descendencia masculina inmediatamente después de la travesía. Se observó ninguna diferencia fenotípica morfológica entre machos diploides y haploides en V. emeryi6,7. Sin embargo, diploide masculina V. emeryi casi invariablemente no desarrollar los testículos. En la ausencia de marcadores genéticos para probar la relación genética de pares usados para el cruce de pruebas, el potencial reproductivo de la prole masculina puede utilizarse para deducir si se ha producido endogamia. Sin embargo, debe señalarse que los machos producidos en endogamia cruces no son siempre estériles en otras especies de himenópteros15,16,17.
El primer paso crítico en el éxito del protocolo es el mantenimiento de colonias bien alimentados, como darles de comer después de que colección de campo aumentará la probabilidad de obtener un número suficiente de reproductores para cruces. En V. emeryi, se ha reportado una correlación positiva entre la nutrición y la producción de reinas de alas largas, que son las reinas que se utiliza para la endogamia cruces10. En insectos sociales, pequeñas colonias o colonias de mala salud, no suelen producir nuevos reproductores18. Por lo tanto, es importante recoger las colonias maduras en el campo y proporcionar cantidades adecuadas de alimentos nutritivos para los experimentos con nuevos reproductores.
El segundo paso crítico es para mantener a los trabajadores, reproductiva y pocas larvas o pupas durante las pruebas de cruce y para mantener la colonia de travesía experimental en el mismo estado que el de una colonia normal hasta completa el cruce (por una semana a un mes). Es difícil mantener las colonias que se van a utilizar para el cruce de pruebas sin trabajadores por más de 3 días porque los hombres son incapaces de alimentarse por sí mismos y deben ser alimentados por los trabajadores. En estas condiciones no naturales, la tasa de éxito de cruzamientos de consanguinidad era extremadamente baja6.
Existen dos limitaciones con respecto a la aplicación de estos protocolos para otras especies de hormigas. En primer lugar, las señales para inducir cruces son especies específicas. Es relativamente fácil inducir cruces laboratorio V. emeryi desde intra-colonias de apareamiento sin vuelo ocurre en la naturaleza. Sin embargo, muchas especies de hormigas han desarrollado rituales de apareamiento que implican vuelos nupciales durante que mate nuevas reinas y machos durante o después del vuelo19. Por lo tanto es importante dilucidar los factores desencadenantes que inducen la travesía de cada especie en un entorno de laboratorio. Por ejemplo, en la hormiga parásita Acromyrmex ameliae, el principal estímulo para la activación de los vuelos nupciales parece luz20. La segunda limitación es, en algunos casos, los machos diploides producidos por cruces de consanguinidad no pueden recogerse como inviable o asesinados por los trabajadores porque ellos no trabajan o no tienen bajo potencial reproductivo y, por lo tanto un costo importante para la colonia de la especies objetivo21,22,23. Afortunadamente, diploide V. emeryi machos no son matados por los trabajadores y viven hasta que mueren naturalmente, lo que sugiere que no encuentran con frecuencia en la naturaleza y una estrategia para excluir a los machos diploides de las colonias no ha evolucionado en esta especie.
En comparación con otras especies de hormigas que emplean arrhenotokous partenogénesis reproducción (figura 1A), podemos asumir que existen ciertas ventajas a la producción de cruces experimentales endogamia mediante V. emeryi androgénesis como el cruces de consanguinidad son genéticamente equivalentes a un retrocruzamiento clásico. De hecho, el sistema nos ha permitido diseñar experimentos para investigar los genes de determinación del sexo, mecanismos moleculares y realizar estudios funcionales en esta especie6,7.
En Resumen, los métodos para llevar a cabo la endogamia cruza y para evaluar el éxito de que cruces se han descrito en c. emeryi. Estos protocolos son esenciales para los experimentos dirigidos a entender las bases genéticas y moleculares de los sistemas de determinación de sexo en los himenópteros.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos al Sr. Taku Shimada, el delegado de AntRoom, Tokio, Japón, por facilitarnos su fotografía de V. emeryi reproductores. Este proyecto fue financiado por la sociedad japonesa para la promoción de la ciencia (JSPS) beca de investigación para jóvenes científicos (16J00011) y concesión de ayudas para jóvenes científicos (B)(16K18626).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plaster powder | N/A | N/A | Any brand can be used |
| Charcoal, Activated, Powder | Wako | 033-02117,037-02115 | |
| Slide glass | N/A | N/A | Any brand can be used |
| Dry Cricket diet | N/A | N/A | Any brand can be used |
| Brown shuger | N/A | N/A | Any brand can be used |
| Styrene Square-Shaped Case | AS ONE | Any size | Size varies by number of ants |
| Incbator | Any brand can be used | ||
| Aluminum block bath Dry thermo unit DTU-1B | TAITEC | 0014035-000 | |
| 1.5mL Hyper Microtube,Clear, Round bottom | WATSON | 131-715CS | |
| Ethanol (99.5) | Wako | 054-07225 | |
| Stereoscopic microscope | N/A | N/A | Any brand can be used |
| Forseps | DUMONT | 0108-5-PO | |
| Chelex 100 sodium form | SIGMA | 11139-85-8 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) Tablets, pH7.4 | TaKaRa | T9181 | |
| Paraformaldehyde | Wako | 162-16065 | |
| -Cellstain- DAPI solution | Dojindo Molecular Technologies | D523 | |
| ABI 3100xl Genetic Analyzer | Applied Biosystems | Directly contact the constructor formore informations. | |
| Confocal laser scanning microscope Leica TCS SP8 | Leica | Directly contact the constructor formore informations. | |
| HC PL APO CS2 20x/0.75 IMM | Leica | Directly contact the constructor formore informations. | |
| HC PL APO CS2 63x/1.20 WATER | Leica | Directly contact the constructor formore informations. | |
| Leica HyDTM | Leica | Directly contact the constructor formore informations. | |
| Leica Application Suite X (LAS X) | Leica | Directly contact the constructor formore informations. |
References
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