荧光显微镜对聚焦超声的刺激
Summary
低强度脉冲超声刺激 (lipus) 是一种非侵入性机械刺激的方式内源性或工程细胞具有较高的空间和时间分辨率。本文介绍了如何将 lipus 应用于荧光显微镜, 以及如何最大限度地减少超声路径上的声阻抗不匹配, 以防止不需要的机械文物。
Abstract
通过聚焦穿透软组织的低强度超声脉冲, lipus 代表了一种很有前途的生物医学技术, 可以远程和安全地操作神经发射、激素分泌和基因重新编程的细胞。然而, 由于缺乏生物物理机制, 目标组织能够感知和响应 lipus, 这一技术在医疗应用中的翻译工作目前受到阻碍。识别这些机制的一个适当方法是使用光学生物传感器与 lipus 相结合, 以确定潜在的信号通路。然而, 将 lipus 应用于荧光显微镜可能会引入不需要的机械人工制品, 因为存在反射、吸收和折射声波的物理界面。本文介绍了一个循序渐进的过程, 将 lipus 集成到商业上可用的直立荧光显微镜上, 同时最大限度地减少沿声学路径的物理界面的影响。描述了一个简单的程序来操作单元超声传感器, 并将传感器的焦点带入目标焦点。利用钙成像技术测量的人胶质母细胞瘤细胞中, 通过 lips 诱导的钙瞬变技术说明了 lipus 的应用。
Introduction
许多疾病需要某种形式的侵入性医疗干预。这些程序往往费用高昂, 风险大, 需要恢复期, 从而给保健系统增加负担。非侵入性治疗方式有可能为传统外科手术提供更安全、更便宜的替代品。然而, 目前的非侵入性方法, 如药物治疗或经颅磁刺激往往受到组织渗透、时空分辨率和不必要的非目标效应之间权衡的限制。在这方面, 聚焦超声是一种很有希望的非侵入性技术, 有可能操纵组织内部深处的生物功能, 具有较高的时空准确性和有限的非目标效应。
聚焦超声刺激包括在生物体深处的精确位置提供声学能量。根据声学脉冲参数, 这种能量可以有多种医学用途。例如, 食品药品监督管理局已批准使用高强度聚焦超声 (hifu) 对前列腺肿瘤、引起震颤的大脑区域、子宫肌瘤和导致疼痛的神经端进行热消融1.hif 介导的微泡空化也被用来短暂地打开血脑屏障, 以便有针对性地提供系统管理的治疗方法2。用于 hfu 应用的空间峰值脉冲平均强度 (isppa) 和空间峰值时间平均强度 (ispta) 通常在几个 kw cm-2 以上, 并产生几十兆帕的脉冲压力。这些强度值远远高于 fda 批准的 isppa和 isppa限制的诊断超声, 190 w 厘米-2和 720 mw 厘米-2, 分别为3。相反, 最近的研究表明, 在诊断超声强度限制 (lipus) 范围内或接近范围内的非破坏性脉冲超声刺激可以有效地远程和安全地操纵神经射击4, 5,6,7,8, 激素分泌9,10和生物工程细胞11。然而, 细胞感知和对超声反应的细胞和分子机制仍不清楚, 排除了 lipus 的临床翻译。因此, 在过去几年中, 超声刺激的人造膜、培养细胞和动物的研究获得了揭示 lipus12,13 调节的生物物理和生理过程的势头. 14,15。
声音是由通过物理介质传播的振动组成的。超声波是一种频率高于人类听觉范围 (即超过20千赫) 的声音。在实验室环境中, 超声波通常由压电传感器产生, 这些传感器包含一种材料, 该材料在特定高频带宽中振荡的电场时振动。有两种类型的传感器: 单元件传感器和传感器阵列。单元件压电换能器具有一个曲面, 作为一个聚焦透镜, 因此将声能集中到一个被称为焦点区的定义区域。单元件传感器比传感器阵列更便宜、更易于操作。本文将重点介绍单元素传感器。
聚焦单元件传感器的焦距大小取决于声学透镜的几何特性及其声学频率。为了使用单个元件传感器实现毫米大小的焦距, 通常需要 mhz 范围内的超声波频率。不幸的是, 在空气等稀薄介质中传播时, 这样频率的声波会非常迅速地衰减。因此, 需要在更密集的材料 (如水) 中生成和传播到样品中的 mhz 超声波。这是将 lipus 模式集成到显微镜中的第一个挑战。
第二个挑战是沿着声路最大限度地减少具有不同声阻抗 (材料密度和声速的乘积) 的材料之间的物理接口。这些接口可以反射、折射、散射和吸收声波, 因此很难量化有效传递到样品的声能量量。它们还可能产生不需要的机械制品。例如, 反射产生的垂直于声学不匹配阻抗接口会产生反向传播波, 从而干扰向前传播的波。沿着干涉路径, 波在称为节点的空间的固定区域相互抵消, 并在称为反节点的交替区域进行求和, 从而产生所谓的驻波 (图 1)。实验者必须能够在体外控制或消除这些实验接口, 因为它们可能在体内不存在。
光学记者荧光测量是一种众所周知的实时询问透明生物样品的方法, 没有物理干扰。因此, 这种方法是 lipus 研究的理想选择, 因为在声纳区域存在的任何物理探针都会引入机械人工制品。该协议描述了 lipus 在商业荧光显微镜上的实现和操作。
Protocol
Representative Results
Discussion
聚焦超声的一个主要优点是能够以高时空精度向生物样品非侵入性地传递机械和热能或热能。其他旨在机械刺激细胞的技术通常采用侵入性物理探针 (如细胞戳), 或需要高能激光束与异物 (如光推子) 相互作用。磁加热可以加热生物样品中的特定空间位置, 但需要存在外来磁性纳米粒子。另一方面, 使用红外或微波激发17、18、19可以?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢米哈伊尔·夏皮罗博士和尼基塔·雷兹尼克博士进行了富有成果的讨论。这项工作得到了西方卫生科学大学启动资金和国家卫生研究院 r21ns101384 赠款的支持。
Materials
| upright microscope with large working volume | Thorlabs | CERNA |
| upright microscope with large working volume | Scientifica | SliceScope |
| optomechanical components | Thorlabs | n/a |
| needle hydrophone | ONDA Corporation | HNP/C/R/A/T series + AH/G pre-amplifier |
| needle hydrophone | Precision Acoustics | n/a |
| fiber optic hydrophone | ONDA Corporation | HFO series |
| fiber optic hydrophone | Precision Acoustics | n/a |
| oscilloscope | Keysight Technology | DSOX2004A (4-channels 70MHz) |
| function generator | Keysight Technology | 33500B (20MHz single-channel) |
| RF power amplifier | Electronic Navigation Industries (ENI) | 325LA, 525LA, 240L, 350L, A075, 2100L, 3100LA |
| RF power amplifier | Electronics & Innovation (E&I) | |
| immersion ultrasound transducer | Olympus | focused immersion transdcuers |
| immersion ultrasound transducer | Benthowave Instrument | HiFu transducer BII-76 series |
| immersion ultrasound transducer | Precision Acoustics | Piezo-ceramic or HiFu transducers |
| immersion ultrasound transducer | Ultrasonic-S-lab | HiFu transducers made to order |
| high-density Matrigel | Corning | VWR 80094-330 |
| Mylar film 2.5 microns | Chemplex | CAT.NO:107 |
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