Çoğullama ultrason stimülasyon floresans mikroskobu ile odaklı
Summary
Düşük yoğunluklu Geniş puls ultrason stimülasyon (LIPUS) yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlük ile endojen veya mühendislik hücrelerinin non-invaziv mekanik uyarılması için bir yöntemi var. Bu makalede nasıl bir epi-floresan mikroskop LIPUS uygulanacağı ve akustik empedans uyuşmazlığı istenmeyen mekanik eserler önlemek için ultrason yol boyunca en aza indirmek nasıl açıklanır.
Abstract
Yumuşak dokulara nüfuz düşük yoğunluktaki ultrason darbeleri odaklanarak, LIPUS sinir ateş, hormon salgılanması ve genetik olarak yeniden programlanan hücreleri uzaktan ve güvenli bir şekilde işlemek için umut verici bir biyomedikal teknoloji temsil eder. Ancak, bu teknoloji tıbbi uygulamalar için çeviri şu anda tarafından hangi biyofiziksel mekanizmaları eksikliği doku anlamda hedef ve LIPUS için yanıt engel oluyor. Bu mekanizmalar tanımlamak için uygun bir yaklaşım sinyal yolları temel belirlemek için LIPUS ile birlikte optik biyosensörler kullanmak olacaktır. Ancak, LIPUS floresan mikroskop için uygulama yansıtmak, emer ve akustik dalgalar yetisiyle fiziksel arabirimleri varlığı nedeniyle istenmeyen mekanik eserler tanıştırayım. Bu makale LIPUS için piyasada bulunan dik epi-floresan mikroskoplar akustik yol boyunca fiziksel arabirimleri etkisini en aza indirerek dahil etmek için adım adım bir yordam sunar. Basit bir yordam bir tek öğeli Ultrason çevirici çalışmasına ve dönüştürücü odak bölge objektif odak noktası getirmek için tasvir edilmiştir. LIPUS kullanımı ile LIPUS kaynaklı kalsiyum geçişler kalsiyum Imaging’i kullanma ölçülen kültürlü insan glioblastoma hücrelerdeki örneği gösterilmektedir.
Introduction
Birçok hastalığın bazı formu invaziv tıbbi müdahale gerektirir. Bu yordamları çoğu kez pahalı, riskli, kurtarma dönemleri gerektirir ve böylece bir yük sağlık sistemleri için ekleyin. Non-invaziv tedavi yöntemleri konvansiyonel cerrahi işlemler daha güvenli ve daha ucuz alternatifler sunmak potansiyeline sahip. Ancak, farmakoterapi veya Transkraniyal Manyetik stimülasyon gibi güncel non-invaziv yaklaşımları kez ticaret-off doku penetrasyon, kronolojik zamanmekansal çözünürlük ve istenmeyen hedef kapalı etkileri arasında tarafından sınırlıdır. Bu bağlamda, biyolojik fonksiyonları işlemek için potansiyeli olan umut verici bir non-invaziv teknoloji odaklı bir ultrason teşkil derin dokularda yüksek kronolojik zamanmekansal doğruluk ve sınırlı hedef kapalı etkileri içinde.
Odaklı ultrason stimülasyon oluşur hassas yerlerde akustik enerji sunma Derinlerde yaşayan organizmalar. Akustik darbe parametreleri bağlı olarak, bu enerji çeşitli tıbbi kullanımlar olabilir. Örneğin, gıda ve İlaç İdaresi onaylanmış yoğun odaklı ultrason (HIFU) kullanımı için prostat tümörleri, tremor neden olan beyin bölgeleri, uterin fibroids ve kemik metastazı1 ağrı neden sinir uçlarının termal ablasyon . HIFU aracılı difüzörü kavitasyon de geçici kan – beyin bariyerini sistemik tarafından idare edilen tedavi2hedeflenen teslim etmek için açmak için kullanılır. Kayma en yüksek Nabız-ortalama yoğunluğu (bensppa) ve kayma en yüksek ortalama zamansal yoğunluk (benspta) uygulamalar genellikle birkaç kW cm-2 ve nabız basıncı MPa birkaç onlarca üretmek HIFU için kullanılan. Bu yoğunluk değerleri çoğu uzakta FDA onaylı bensppa vespta sınırları tanılama ultrason, 190 W cm-2 ve 720 mW cm-2, sırasıyla3. Buna ek olarak, son yıllarda yapılan çalışmalarda içinde veya yakınında tanılama ultrason yoğunluğu sınırları (LIPUS) dizi etkili ve güvenli bir şekilde uzaktan nöral işlemek için4ateş vardır o tahribatsız pulsed ultrason stimülasyon göstermiştir, 5,6,7,8, hormon salgılanması9,10 ve Biyomühendislik hücreleri11. Henüz, hangi hücreleri hissediyorum ve ultrason için yanıt hücresel ve moleküler mekanizmaları belirsiz, klinik LIPUS tercümesi iyileştirmelerden kalır. Dolayısıyla, son birkaç yıl içinde Yapay membran, kültürlü hücreleri ve hayvanlar ultrason ile uyarılan biyofiziksel ortaya çıkarmak için bir ivme kazanmış ve fizyolojik süreçleri LIPUS12,13tarafındanmodülasyonlu, 14,15.
Fiziksel bir medya yayılıyor bir titreşim ses oluşur. Ultrason ile bir frekans insan sesli aralığı (Yani, yukarıda 20 kHz) yukarıda bir sesi. Bir laboratuvar ortamda ultrason dalgaları genellikle belirli bir yüksek frekans bant içinde salınan bir elektrik alanı cevaben titreşir bir materyal içeren piezoelektrik güç çeviriciler tarafından üretilmektedir. Güç çeviriciler iki türü bulunmaktadır: tek öğe dönüştürücüler ve dönüştürücü diziler. Tek öğe piezoelektrik güç çeviriciler odaklama bir objektif olarak geçecek olan ve, bu nedenle akustik enerji odak bölgesi adı verilen tanımlanmış bir bölgeye yoğunlaşmaktadır bir eğri yüzey sahip. Tek öğe güç çeviriciler çok daha ucuz ve daha kolay dönüştürücü diziler çalıştırmak. Bu madde tek öğe dönüştürücü üzerinde durulacak.
Bir odaklanan tek öğe çevirici odak bölgenin boyutunu akustik mercek geometrik özellikleri ve akustik frekansını bağlıdır. Bir milimetre boyutunda odak bölge bir tek öğe çevirici ile elde etmek için ultrason frekansları MHz aralığında genellikle gereklidir. Ne yazık ki, bu tür frekansta akustik dalgalar çok hızlı bir şekilde ne zaman hava gibi ince bir ortamda yayılır zayıflatılmış. Böylece, MHz ultrason dalgaları üretilecek ve su gibi daha yoğun bir malzeme örnek yayılır gerek. Bu LIPUS modalite mikroskop için entegre ilk meydan okuma kabul ettiğiniz anlamına gelir.
Fiziksel arabirimler arasında (ki bir ürün malzeme yoğunluğu ve akustik hız) farklı akustik impedances akustik yol boyunca malzemelerle en aza indirmek için ikinci bir mücadeledir. Bu arabirimler yansıtabilir, olurlar, dağılım ve akustik dalgalar, etkili bir örnek için teslim akustik enerji miktarı ölçmek üzere emerler. Onlar istenmeyen mekanik eserler acabilirsiniz. Örneğin, ileri yayılıyor olanlar ile müdahale backpropagating dalgalar yansımaları üretilen dik akustik uyuşmazlığı empedans arabirimleri oluşturun. Girişime yol boyunca dalgalar her diğer alanlarda düğümleri ve anti-düğümleri, denilen bölgeler alternatif, özetle denilen sabit bölgelerinde, sözde duran dalgalar (Şekil 1) oluşturmayı iptal etmek. Onlar içinde vivoolmayabilir gibi bu deneysel arabirimler içinde vitro ortadan kaldırmak veya kontrol edebilmek deneyci için önemlidir.
Optik gazetecilere floresans ölçüm şeffaf biyolojik örnekler gerçek zamanlı olarak ve hiçbir fiziksel rahatsızlık ile sorguya çekmek için iyi bilinen bir yöntemdir. Bu yaklaşım böylece herhangi bir fiziksel probları sonicated alanında mevcut mekanik eserler tanıtacak olarak LIPUS çalışmaları için idealdir. Bu iletişim kuralı uygulama ve LIPUS çalışması için bir ticari epi-floresan mikroskop açıklanmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Büyük avantajı odaklı ultrason non-invaziv mekanik ve/veya termal enerji yüksek spatio-temporal hassasiyetle biyolojik örnekler sunmak için onun yetenek olduğunu. Mekanik olarak teşvik amacıyla diğer teknikleri genellikle istihdam invaziv fiziksel problar (Örneğin, hücre alay) hücreleri veya yabancı nesneler (Örneğin, Optik cımbız) yüksek enerjili lazer ışınları etkileşim gerektirir. Manyetik Isıtma biyolojik örnekler içinde belirli uzamsal konumları ısı olabilir ama yaba…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Drs. Mikhail Shapiro ve Nikita Reznik verimli tartışmalar için teşekkür ederiz. Bu eser Western Üniversitesi Sağlık Bilimleri fonlarından start-up tarafından desteklenen ve NIH R21NS101384 verin.
Materials
| upright microscope with large working volume | Thorlabs | CERNA |
| upright microscope with large working volume | Scientifica | SliceScope |
| optomechanical components | Thorlabs | n/a |
| needle hydrophone | ONDA Corporation | HNP/C/R/A/T series + AH/G pre-amplifier |
| needle hydrophone | Precision Acoustics | n/a |
| fiber optic hydrophone | ONDA Corporation | HFO series |
| fiber optic hydrophone | Precision Acoustics | n/a |
| oscilloscope | Keysight Technology | DSOX2004A (4-channels 70MHz) |
| function generator | Keysight Technology | 33500B (20MHz single-channel) |
| RF power amplifier | Electronic Navigation Industries (ENI) | 325LA, 525LA, 240L, 350L, A075, 2100L, 3100LA |
| RF power amplifier | Electronics & Innovation (E&I) | |
| immersion ultrasound transducer | Olympus | focused immersion transdcuers |
| immersion ultrasound transducer | Benthowave Instrument | HiFu transducer BII-76 series |
| immersion ultrasound transducer | Precision Acoustics | Piezo-ceramic or HiFu transducers |
| immersion ultrasound transducer | Ultrasonic-S-lab | HiFu transducers made to order |
| high-density Matrigel | Corning | VWR 80094-330 |
| Mylar film 2.5 microns | Chemplex | CAT.NO:107 |
References
- Elhelf, I. A. S., et al. High intensity focused ultrasound: The fundamentals, clinical applications and research trends. Diagnostic and Interventional Imaging. 99 (6), 349-359 (2018).
- Toccaceli, G., Delfini, R., Colonnese, C., Raco, A., Peschillo, S. . Emerging strategies and future perspective in neuro-oncology using Transcranial Focused Ultrasound Technology. , (2018).
- Duck, F. A. Medical and non-medical protection standards for ultrasound and infrasound. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 93 (1-3), 176-191 (2007).
- Legon, W., et al. Transcranial focused ultrasound modulates the activity of primary somatosensory cortex in humans. Nature Neuroscience. 17 (2), 322-329 (2014).
- Tyler, W. J. The mechanobiology of brain function. Nature Reviews: Neuroscience. 13 (12), 867-878 (2012).
- Tyler, W. J. Noninvasive neuromodulation with ultrasound? A continuum mechanics hypothesis. Neuroscientist. 17 (1), 25-36 (2011).
- Tufail, Y., et al. Transcranial pulsed ultrasound stimulates intact brain circuits. Neuron. 66 (5), 681-694 (2010).
- Tyler, W. J., et al. Remote excitation of neuronal circuits using low-intensity, low-frequency ultrasound. PloS One. 3 (10), e3511 (2008).
- Suarez Castellanos, I., et al. Calcium-dependent ultrasound stimulation of secretory events from pancreatic beta cells. Journal of Therapeutic Ultrasound. 5, 30 (2017).
- Suarez Castellanos, I., Jeremic, A., Cohen, J., Zderic, V. Ultrasound Stimulation of Insulin Release from Pancreatic Beta Cells as a Potential Novel Treatment for Type 2 Diabetes. Ultrasound in Medicine and Biology. 43 (6), 1210-1222 (2017).
- Ibsen, S., Tong, A., Schutt, C., Esener, S., Chalasani, S. H. Sonogenetics is a non-invasive approach to activating neurons in Caenorhabditis elegans. Nature Communications. 6, 8264 (2015).
- Prieto, M. L., Firouzi, K., Khuri-Yakub, B. T., Maduke, M. Activation of Piezo1 but Not NaV1.2 Channels by Ultrasound at 43 MHz. Ultrasound in Medicine and Biology. 44 (6), 1217-1232 (2018).
- Kubanek, J., et al. Ultrasound modulates ion channel currents. Scientific Reports. 6, 24170 (2016).
- Prieto, M. L., Omer, O., Khuri-Yakub, B. T., Maduke, M. C. Dynamic response of model lipid membranes to ultrasonic radiation force. PloS One. 8 (10), e77115 (2013).
- Sato, T., Shapiro, M. G., Tsao, D. Y. Ultrasonic Neuromodulation Causes Widespread Cortical Activation via an Indirect Auditory Mechanism. Neuron. 98 (5), 1031-1041 (2018).
- O’Brien, W. D. Ultrasound-biophysics mechanisms. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 93 (1-3), 212-255 (2007).
- Shapiro, M. G., Homma, K., Villarreal, S., Richter, C. P., Bezanilla, F. Corrigendum: Infrared light excites cells by changing their electrical capacitance. Nature Communications. 8, 16148 (2017).
- Shapiro, M. G., Homma, K., Villarreal, S., Richter, C. P., Bezanilla, F. Infrared light excites cells by changing their electrical capacitance. Nature Communications. 3, 736 (2012).
- Shapiro, M. G., Priest, M. F., Siegel, P. H., Bezanilla, F. Thermal mechanisms of millimeter wave stimulation of excitable cells. Biophysical Journal. 104 (12), 2622-2628 (2013).
- Hwang, J. Y., et al. Investigating contactless high frequency ultrasound microbeam stimulation for determination of invasion potential of breast cancer cells. Biotechnology and Bioengineering. 110 (10), 2697-2705 (2013).
- Nakano, M., et al. Genetically encoded ratiometric fluorescent thermometer with wide range and rapid response. PloS One. 12 (2), e0172344 (2017).
- Donner, J. S., Thompson, S. A., Kreuzer, M. P., Baffou, G., Quidant, R. Mapping intracellular temperature using green fluorescent protein. Nano Letters. 12 (4), 2107-2111 (2012).
