Multiplexage axé Stimulation ultrason avec la microscopie en Fluorescence
Summary
Stimulation d’ultrasons pulsés faible intensité (LIPUS) est une modalité pour une stimulation mécanique non invasif des cellules endogènes ou machinés avec une haute résolution spatiale et temporelle. Cet article explique comment implémenter LIPUS à un microscope épifluorescente et comment minimiser les différences d’impédance acoustique sur le chemin de l’échographie pour empêcher des objets mécaniques non désirés.
Abstract
En se concentrant des pulsations d’ultrasons de basse intensité qui pénètrent dans les tissus mous, LIPUS représente une technologie biomédicale prometteuse à distance et en toute sécurité manipuler tir neuronaux, sécrétion hormonale et cellules reprogrammées génétiquement. Cependant, la traduction de cette technologie pour des applications médicales est actuellement entravée par un manque de mécanismes biophysiques qui ciblés sens de tissus et de répondre aux LIPUS. Une méthode adaptée pour identifier ces mécanismes serait d’utiliser des biocapteurs optiques en combinaison avec LIPUS pour déterminer qui sous-tendent les voies de signalisation. Toutefois, appliquer LIPUS à un microscope à fluorescence peut introduire des objets mécaniques indésirables en raison de la présence d’interfaces physiques qui reflètent, d’absorber et de réfraction des ondes acoustiques. Cet article présente une procédure pas à pas pour se lient LIPUS microscopes épifluorescente verticale disponible dans le commerce tout en minimisant l’influence des interfaces physiques le long de la trajectoire acoustique. On décrit une méthode simple pour l’exploitation d’un seul élément transducteur et à intégrer la zone focale du capteur de point focal objectif. L’utilisation de LIPUS est illustrée par un exemple de calcium induite par LIPUS transitoires dans les cellules de glioblastome humain cultivées mesurées à l’aide d’imagerie calcique.
Introduction
De nombreuses maladies nécessitent une forme quelconque d’intervention médicale invasive. Ces procédures sont souvent coûteux, risqué, exigent des périodes de récupération et donc ajouter un fardeau aux systèmes de soins de santé. Modalités thérapeutiques non invasifs sont susceptibles de fournir des solutions de rechange sûres et peu coûteuse pour des procédures chirurgicales conventionnelles. Toutefois, les approches actuelles non invasives telles que la stimulation magnétique transcrânienne ou de pharmacothérapie sont souvent limités par des compromis entre la pénétration tissulaire, résolution spatio-temporelle et des effets indésirables hors cible. Dans ce contexte, un ultrasons focalisés constituent une technologie non invasive prometteuse avec la possibilité de manipuler les fonctions biologiques profondément à l’intérieur des tissus avec haute précision spatio-temporelle et limité les effets hors cible.
Ultrasons focalisés stimulation consiste en délivrant une énergie acoustique à des emplacements précis profondément à l’intérieur des organismes vivants. En fonction des paramètres d’impulsions acoustiques, cette énergie peut avoir une variété d’utilisations médicales. Par exemple, la Food and Drug Administration a approuvé l’utilisation d’ultrasons de concentré de haute intensité (HiFU) pour ablation thermique de tumeurs prostatiques, causant des tremblements des régions du cerveau, les fibromes utérins et causant douleur de terminaisons nerveuses dans les métastases osseuses1 . Cavitation induite par HiFu microbulles est également utilisée pour ouvrir transitoirement la barrière hémato – encéphalique pour l’administration ciblée de produits thérapeutiques administrés par voie générale2. L’intensité moyenne des impulsions spatiale de pointe (j’aiLECL) et spatial-pic d’intensité moyenne temporelle (j’aispta) utilisé pour HiFU applications sont généralement au-dessus de plusieurs kW cm-2 et produisent la pression différentielle de plusieurs dizaines de MPa. Ces valeurs sont bien au-dessus de la FDA a approuvé ILECL et j’aispta limites d’échographie diagnostique, de 190 W cm-2 et de 720 mW cm-2, respectivement3. En revanche, les études récentes ont montré que la stimulation non destructifs ultrasons pulsés qui sont dans ou près de la plage des limites d’intensité de diagnostic par ultrasons (LIPUS) peut être efficace pour manipuler les neurones à distance et en toute sécurité de tir4, 5,6,7,8, sécrétion hormonale9,10 et génie génétique des cellules11. Pourtant, les mécanismes cellulaires et moléculaires par lesquels cellules détecter et répondent aux ultrasons restent floues, excluant la traduction clinique de LIPUS. Donc, dans quelques années, des études des membranes artificielles, des cellules cultivées et des animaux stimulés par des ultrasons ont pris de l’ampleur pour révéler biophysiques et processus physiologiques modulées par LIPUS12,13, 14,15.
Les sons composés d’une vibration se propageant à travers un support physique. Un ultrason est un son avec une fréquence supérieure à la gamme audible humaine (c’est-à-dire supérieures à 20 kHz). Dans un environnement de laboratoire, des ondes ultrasoniques sont généralement fabriqués par des transducteurs piézoélectriques qui contiennent un matériau qui vibre en réponse à un champ électrique oscillant dans une largeur de bande haute fréquence spécifique. Il existe deux types de transducteurs : simple monoéléments et transducteurs. Piézoélectrique monoéléments possèdent une surface courbée qui agit comme une lentille de focalisation et donc se concentre une énergie acoustique dans une région donnée, appelée la zone focale. Monoéléments sont beaucoup moins cher et plus facile à exploiter que les transducteurs. Cet article se concentrera sur monoéléments.
La taille de la zone focale d’un transducteur unique élément dépend des propriétés géométriques de la lentille acoustique et sa fréquence acoustique. Pour atteindre une zone focale millimètre-taille avec un monoélément, fréquences d’ultrasons dans la gamme MHz sont généralement nécessaires. Malheureusement, les ondes acoustiques à une fréquence sont atténués très rapidement lorsque se propageant dans un milieu fragile tel que l’air. Ainsi, des ondes ultrasoniques MHz doivent être générés et propagées à l’échantillon dans un matériau plus dense comme l’eau. Ceci constitue le premier défi en intégrant la modalité LIPUS à un microscope.
Un deuxième défi est de réduire au minimum les interfaces physiques entre les matériaux avec différentes impédances acoustiques (qui est un produit de masse volumique et la vitesse acoustique) le long de la trajectoire acoustique. Ces interfaces peuvent refléter, réfraction, dispersion et absorbent les ondes acoustiques, rendant difficile de quantifier la quantité d’énergie acoustique effectivement livrée à un échantillon. Ils peuvent également créer des objets mécaniques non désirés. Par exemple, les réflexions incompatibilité perpendiculaire à acoustique produit impédance interfaces créent des ondes de backpropagating qui interfèrent avec ceux de multiplication avant. Sur le chemin de l’interférence, les ondes s’annulent mutuellement à des régions fixes des espaces appelés nœuds et résumer en alternant zones appelées anti-noeuds, créant ce que l’on appelle ondes stationnaires (Figure 1). Il est important pour l’expérimentateur d’être en mesure de contrôler ou éliminer ces interfaces expérimentales in vitro comme ils peuvent ne pas exister in vivo.
Mesure de la fluorescence de reporters optiques est une méthode bien connue d’interroger des échantillons biologiques transparents en temps réel et avec aucune perturbation physique. Cette approche est donc idéale pour les études LIPUS car les sondes physiques présents dans la région aux ultrasons présentera des objets mécaniques. Ce protocole décrit la mise en œuvre et le fonctionnement du LIPUS à un microscope épifluorescente commerciale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un avantage principal des ultrasons focalisés est sa capacité à livrer non invasive énergie mécanique ou thermique d’échantillons biologiques avec une grande précision temporelle. Autres techniques destinés à stimuler mécaniquement des cellules habituellement employer envahissantes sondes physiques (p. ex., cellule-piquer) ou requiert l’interaction des faisceaux lasers de haute énergie avec des objets étrangers (p. ex., les pinces optiques). Chauffage magnétique peut chauffer les emplac…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions les Drs Mikhail Shapiro et Nikita Reznik de discussions fructueuses. Ce travail a été soutenu par des fonds de démarrage de la Western University of Health Sciences et NIH grant R21NS101384.
Materials
| upright microscope with large working volume | Thorlabs | CERNA |
| upright microscope with large working volume | Scientifica | SliceScope |
| optomechanical components | Thorlabs | n/a |
| needle hydrophone | ONDA Corporation | HNP/C/R/A/T series + AH/G pre-amplifier |
| needle hydrophone | Precision Acoustics | n/a |
| fiber optic hydrophone | ONDA Corporation | HFO series |
| fiber optic hydrophone | Precision Acoustics | n/a |
| oscilloscope | Keysight Technology | DSOX2004A (4-channels 70MHz) |
| function generator | Keysight Technology | 33500B (20MHz single-channel) |
| RF power amplifier | Electronic Navigation Industries (ENI) | 325LA, 525LA, 240L, 350L, A075, 2100L, 3100LA |
| RF power amplifier | Electronics & Innovation (E&I) | |
| immersion ultrasound transducer | Olympus | focused immersion transdcuers |
| immersion ultrasound transducer | Benthowave Instrument | HiFu transducer BII-76 series |
| immersion ultrasound transducer | Precision Acoustics | Piezo-ceramic or HiFu transducers |
| immersion ultrasound transducer | Ultrasonic-S-lab | HiFu transducers made to order |
| high-density Matrigel | Corning | VWR 80094-330 |
| Mylar film 2.5 microns | Chemplex | CAT.NO:107 |
References
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