大鼠骨髓破骨衣原体的分离、纯化及鉴别
Summary
破骨细胞是来源于造血干细胞单核巨噬细胞谱系的组织特异性巨噬细胞多核细胞。该方案描述了如何分离骨髓细胞, 以便获得大量的破骨细胞, 同时降低传统方法中发现的事故风险。
Abstract
骨细胞是大的, 多核的, 和骨吸收细胞的单核细胞巨噬细胞谱系, 形成的单核细胞或巨噬细胞前体的融合。过度的骨吸收是导致溶骨性疾病的最重要的细胞机制之一, 包括骨质疏松症、牙周炎和假体周围骨溶解。破骨细胞的主要生理功能是吸收羟基磷灰石矿物成分和骨的有机基质, 在骨骼表面产生典型的吸收外观。与体内其他细胞相比, 破骨细胞相对较少, 尤其是在成人骨骼中。最近的研究集中在如何在更短的时间内获得更成熟的破骨细胞, 这一直是一个问题。为了获得更成熟的破骨细胞, 实验室在分离和培养技术方面有了一些改进。在这里, 我们介绍了一种方法, 分离骨髓在更短的时间和更少的努力, 与传统的程序相比, 使用一个特殊和简单的设备。利用密度梯度离心技术, 我们从大鼠骨髓中获得了大量完全分化的破骨细胞, 并采用经典方法进行鉴定。
Introduction
骨稳态是一个复杂的生理过程, 是由骨吸收破骨细胞和成骨细胞1调节。在成骨细胞和破骨细胞活动之间的平衡, 分别通过成骨细胞和破骨细胞介导, 是非常重要的, 以维持骨骼健康和稳态, 因为在骨稳态的摄动可能会导致骨骼疾病, 如骨生长异常或骨密度下降。破骨细胞作为独特的骨吸收细胞, 在与异常骨破坏相关的疾病中非常重要, 包括骨质疏松症、牙周炎和假体周围骨溶解2,3。
破骨细胞培养的发展主要分为两个阶段。Boyde 等人和chambers等人确定的方法构成了1980年代的第一阶段。他们从新生动物的骨骼中获得了相对丰富的破骨细胞, 这是一个快速的重塑期。骨细胞克隆通过在特殊培养基中的碎裂和搅拌来释放。然而, 这种方法获得的细胞数量和纯度都很低。第二阶段是利用从骨髓6中提取的造血谱系细胞, 发展成骨细胞的长程培养。细胞因子, 如1α、25-二羟基维生素 d3、前列腺素 e2 (pge-2) 和甲状旁腺激素 (pth), 加入培养基, 通过成骨细胞/基质细胞系统作用,刺激破骨细胞形成 7,8.然而, 该方法获得的破骨细胞的纯度和数量不能满足现代分子生物学研究的需要。然后, 巨噬细胞集落刺激因子 (m-csf) 和受体激活剂的发现核因子-b 配体 (rankl) 使骨细胞生成更容易 9,10,11, 并使用 m-csf 和RANKL 直接刺激破骨细胞的形成在世界范围内得到了广泛的应用。然而, 方法中仍有一些细节需要改进。
目前, 最常用的破骨细胞培养方法, 如 Marino等人12和pei 等 13所述, 通常需要切除骨周围的周围组织, 并使用消毒针冲洗骨髓腔。完成的媒体。这个过程有一些缺点, 包括 (1) 切除周围的组织周围的组织需要大量的时间和伟大的手术技术, (2) 骨骼是脆弱的, 可以导致骨髓流出, (3) 骨髓腔可能是太小, 不能冲洗, (4) 有针头受伤的风险。为了避免这些问题, 我们离心管含有骨髓的骨头, 而不是针头冲洗骨髓。在这里, 我们介绍了一种稳定和安全的方法, 分离骨髓在更短的时间和更少的努力相比, 传统的程序。结合密度梯度离心, 我们在体外获得大量完全分化的破骨细胞.
Protocol
Representative Results
Discussion
对于任何希望研究骨代谢的研究人员来说, 体外获得和研究破骨细胞的能力是一项关键和基本的技能, 这可能有助于了解骨吸收不良的机制, 并开发出新的治疗药物。本研究描述了一种基于以往方法的协议, 并进行了一些修改。
与传统方法相比, 采用移液器吸头和微离心管获得骨髓, 大大缩短了获得骨髓的手术时间和实验室人员的工作量。同时, 该方法避免了骨髓丢失或针杆损伤…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了国家自然科学基金 (81473692) 对马勇的支持。作者感谢南京中医药大学第一临床医学院医学研究中心的全体工作人员。
Materials
| Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
| Automatic Hard Tissue Slicer | Lecia | RM2265 | |
| Bovine femoral bone | Purchased by ourselves | ||
| Cell Incubator | Heraus | BB16/BB5060 | |
| Fetal Bovine Serum | Sarana | s-fbs-au-015 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150077 | |
| Hard Tissue Grinders | Lecia | SP-2600 | |
| Histopaque Kit | TianJing Haoyang | TBD2013DR | Silicified centrifugal tube amd cell separation solution |
| Hochest33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | |
| Inverted Phase Contrast Microscope | Olympus | CKX31 | |
| Inverted Fluorescence Microscope | Lecia | DMI-3000 | |
| MEM, no Glutamine | Gibco | 11090-081 | |
| Penicillin-Streptomycin, Liquid | Gibco | 15140122 | |
| Rabbit Anti-Calcitonin receptor | Bioss | bs-0124R | |
| Recombinant Rat M-CSF | PeproTech | 400-28 | |
| Recombinant Rat sRANK Ligand | PeproTech | 400-30 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Absin | abs47014932 | |
| Scanning Electron Microscopy | FEI | Quanta 200 | |
| Toluidine Blue | Sigma-Aldrich | 89649 |
References
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