בידוד, טיהור, והבידול של אוסטאוקלסט מקדים של מח עצם חולדה
Summary
אוסטאופנוקיים הם מקרופאג polykaryons רקמות שמקורם השושלת המונציט מקרופאג של תאי גזע המטפאות. פרוטוקול זה מתאר כיצד לבודד את התאים מח עצם כך כמויות גדולות של אוסטאוקלמות מתקבלים תוך צמצום הסיכון של תאונות שנמצאו בשיטות מסורתיות.
Abstract
האוסטאופנות הינן גדולות, בנות בנות, ותאי-ספיגת עצמות של שושלת היוחסין המקרופאג מונוציט, הנוצרות על ידי היתוך של מונוציטים או מקרופאג פראוסמנים. ספיגת עצם מוגזמת הוא אחד המנגנונים הסלולריים המשמעותיים ביותר המובילים למחלות מחלות נגד חרדה, כולל אוסטאופורוזיס, חניכיים, ו אוסטאופוליזיס periprosthetic. הפונקציה הפיסיולוגית העיקרית של האוסטאופתית היא לקלוט גם את רכיב המינרלים של ההידרוקסיטיט ואת המטריצה האורגנית של העצם, וליצור את המראה הספיגת האופייני על פני העצמות. יש מעט מאוד אוסטאוקיים בהשוואה לתאים אחרים בגוף, במיוחד בעצמות למבוגרים. מחקרים שנעשו לאחרונה התמקדו כיצד להשיג osteoclasts וגרים יותר בזמן פחות, אשר תמיד היה בעיה. מספר שיפורים בטכניקות הבידוד והתרבות פותחו במעבדות על מנת להשיג האוסטאופי בוגרים יותר. כאן, אנו מציגים שיטה המבודדת מח עצם בפחות זמן, עם פחות מאמץ לעומת ההליך המסורתי, באמצעות מכשיר מיוחד ופשוט. עם השימוש של צפיפות צנטריפוגה הדרגתי, אנו משיגים כמויות גדולות של osteoclasts בדיל מלא של מח עצם החולדה, אשר מזוהים על ידי שיטות קלאסיות.
Introduction
הומאוסטזיס העצם הוא תהליך פיזיולוגי מורכב מוסדר על ידי עצם-ספיגת בינג העצמות האוסטאופתית והעצם יוצר אוסטאופתית1. איזון בין פעילות osteoblastic האוסטטית בתיווך באמצעות אוסטאופיות ואוסטאופתנמשך, בהתאמה, הוא חיוני מאוד לשמירה על בריאות העצם הומאוסטזיס, כי רטבאליות הומאוסטזיס העצם עלול להוביל למחלות עצם, כגון כמו צמיחה עצם נורמלי או אובדן של צפיפות העצם. כמו תאים לספיגת עצם ייחודי, האוסטאופתיים חשובים מחלות הקשורות להשמדה העצם נורמלי, כולל אוסטאופורוזיס, חניכיים, ו perioly, ו הפריתותבת2,3.
התפתחות התרבות האוסטאופתיים מחולקת בעיקר לשני שלבים. השיטות שנקבעו על ידי Boyde et al.4 וצ’יימברס ואח ‘5 הלחין את השלב הראשון בשנות השמונים. הם השיגו שופע אוסטאופי עשיר יחסית מעצמותיו של בעלי חיים היילוד, שהיא תקופת השיפוצים המהירה. האוסטאופתות משתחררים על ידי מקטעים ומערבב את העצמות במדיום מיוחד. עם זאת, התאים שהושגו בשיטה זו נמוכים בכמות ובטוהר. השלב השני היה פיתוח של תרבויות ארוכת טווח של היווצרות אוסטאוקלסט, באמצעות תאים השושלת המטתית נגזר מח העצם6. ציטוקינים, כגון 1α, 25-דיהידרוטסטוסטרון ויטמין D3, proגלנדין E2 (pge-2), ו הורמון יותרת התריס (pge), אשר מתווספים לתוך המדיום תרבות, לפעול באמצעות מערכת של התאים האוסטאופתיים/סטרומה כדי לעורר את היווצרות אוסטאוקלסט7,8 . עם זאת, הטוהר וכמות האוסטאופה המתקבלים על ידי שיטה זו אינם יכולים לענות על הצרכים של מחקר הביולוגיה המולקולרית המודרנית. לאחר מכן, התגלית של גורם מעורר מקרופאג המושבה (M-שדרתי) ו קולטן activator עבור גורם גרעיני-κB ליגנד (rankl) להפוך osteoclastogenesis קל יותר9,10,11, ואת השיטה של שימוש בשיטת M-שדרתי ו Rankl לעירור ישיר היווצרות אוסטאוקלסט נמצא בשימוש נרחב ברחבי העולם. עם זאת, יש עדיין כמה פרטים במתודולוגיה כי יש צורך לשפר.
כיום, שיטת התרבות הנפוצה ביותר הנפוץ ביותר, כפי שמתואר על ידי מרינו ואח ‘12 ו-פיי et al.13, לעתים קרובות דורש הסרת הרקמה הסובבת סביב העצם ומשתמשת במחט מחוטאת כדי לשטוף את חלל מח המוח עם מדיה שהושלמה. ישנם כמה החסרונות לתהליך זה, כולל העובדה (1) הסרת הרקמה המקיפה סביב העצם דורש זמן רב וטכניקה כירורגית גדולה, (2) העצמות הם שבירים יכול להוביל מח עצם תזרים, (3) חלל מח העצם עשוי להיות זעיר מדי כדי סומק, ו (4) יש סיכון של פציעה מקל מחט. כדי למנוע בעיות אלה, אנו מצנטריפוגה את הצינורות המכילים את העצמות של מח עצם במקום מחט-לרוקן את מח העצם. כאן, אנו מציגים שיטה יציבה ובטוחה אשר מבודד מח עצם בפחות זמן עם פחות מאמץ לעומת ההליך המסורתי. יחד עם השימוש של צפיפות צנטריפוגה הדרגתי, אנו משיגים כמויות גדולות של אוסטאוקלטורים מובחנים מלאים בתוך מבחנה.
Protocol
Representative Results
Discussion
היכולת להשיג וללמוד אוסטאופאוקיים בתחום החוץ הוא מיומנות קריטית ויסודית עבור כל חוקר המבקש ללמוד מטבוליזם העצם, אשר עשוי לעזור להבין את המנגנונים של מחלות העצם קליטת ולפתח סוכנים טיפוליים חדשניים. המחקר הנוכחי תיאר פרוטוקול עם כמה שינויים המבוססים על שיטות קודמות.
באמצעו?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (81473692) ליונג מא. המחברים מודים לכל הצוות של מרכז המחקר הרפואי של המכללה הראשונה לרפואה קלינית באוניברסיטת נאנג’ינג של הרפואה הסינית.
Materials
| Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
| Automatic Hard Tissue Slicer | Lecia | RM2265 | |
| Bovine femoral bone | Purchased by ourselves | ||
| Cell Incubator | Heraus | BB16/BB5060 | |
| Fetal Bovine Serum | Sarana | s-fbs-au-015 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150077 | |
| Hard Tissue Grinders | Lecia | SP-2600 | |
| Histopaque Kit | TianJing Haoyang | TBD2013DR | Silicified centrifugal tube amd cell separation solution |
| Hochest33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | |
| Inverted Phase Contrast Microscope | Olympus | CKX31 | |
| Inverted Fluorescence Microscope | Lecia | DMI-3000 | |
| MEM, no Glutamine | Gibco | 11090-081 | |
| Penicillin-Streptomycin, Liquid | Gibco | 15140122 | |
| Rabbit Anti-Calcitonin receptor | Bioss | bs-0124R | |
| Recombinant Rat M-CSF | PeproTech | 400-28 | |
| Recombinant Rat sRANK Ligand | PeproTech | 400-30 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Absin | abs47014932 | |
| Scanning Electron Microscopy | FEI | Quanta 200 | |
| Toluidine Blue | Sigma-Aldrich | 89649 |
References
- Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).
- Kular, J., Tickner, J., Chim, S. M., Xu, J. K. An overview of the regulation of bone remodelling at the cellular level. Clinical Biochemistry. 45 (12), 863-873 (2012).
- Park, S. J., et al. Apoptosis of the reduced enamel epithelium and its implications for bone resorption during tooth eruption. Journal Of Molecular Histology. 44 (1), 65-73 (2013).
- Boyde, A., Ali, N. N., Jones, S. J. Resorption of dentine by isolated osteoclasts in vitro. British Dental Journal. 156 (6), 216-220 (1984).
- Chambers, T. J., Revell, P. A., Fuller, K., Athanasou, N. A. Resorption of bone by isolated rabbit osteoclasts. Journal of Cell Science. 66, 383-399 (1984).
- Takahashi, N., et al. Osteoclast-like cell formation and its regulation by osteotropic hormones in mouse bone marrow cultures. Endocrinology. 122 (4), 1373-1382 (1988).
- Takahashi, N., et al. Osteoblastic cells are involved in osteoclast formation. Endocrinology. 123 (5), 2600-2602 (1988).
- Suda, T., Takahashi, N., Martin, T. J. Modulation of osteoclast differentiation. Endocrine Reviews. 13 (1), 66-80 (1992).
- Yoshida, H., et al. The murine mutation osteopetrosis is in the coding region of the macrophage colony stimulating factor gene. Nature. 345 (6274), 442-444 (1990).
- Yasuda, H., et al. Osteoclast differentiation factor is a ligand for osteoprotegerin/osteoclastogenesis-inhibitory factor and is identical to TRANCE/RANKL. Proceedings of The National Academy of Sciences of The United States of America. 95 (7), 3597-3602 (1998).
- Lacey, D. L., et al. Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation. Cell. 93 (2), 165-176 (1998).
- Marino, S., Logan, J. G., Mellis, D., Capulli, M. Generation and culture of osteoclasts. BoneKEy Reports. 3, 570 (2014).
- Pei, J. R., et al. Fluoride decreased osteoclastic bone resorption through the inhibition of NFATc1 gene expression. Environmental Toxicology. 29 (5), 588-595 (2014).
- Arnett, T. R., Dempster, D. W. Effect of pH on bone resorption by rat osteoclasts in vitro. Endocrinology. 119 (1), 119-124 (1986).
- Arnett, T. R., et al. Hypoxia is a major stimulator of osteoclast formation and bone resorption. Journal of Cellular Physiology. 196 (1), 2-8 (2003).
- Orriss, I. R., Arnett, T. R. Rodent osteoclast cultures. Methods in Molecular Biology. 816, 103-117 (2012).
- Quinn, J. M., et al. Calcitonin receptor antibodies in the identification of osteoclasts. Bone. 25 (1), 1-8 (1999).
