Gli osteoclasti sono polykaryons di macrofage specifici del tessuto derivato dal lignaggio dei monociti-macrofage delle cellule staminali ematopoietiche. Questo protocollo descrive come isolare le cellule del midollo osseo in modo da ottenere grandi quantità di osteoclasti riducendo il rischio di incidenti riscontrati nei metodi tradizionali.
Gli osteoclasti sono cellule grandi, multinucleate e di riassorbimento osseo del lignaggio dei monociti-macrofage che sono formate dalla fusione di monociti o precursori di macrofage. Un eccessivo riassorbimento osseo è uno dei meccanismi cellulari più significativi che portano a malattie osteolitiche, tra cui l’osteoporosi, la parodontite e l’osteolisi periprotesica. La principale funzione fisiologica degli osteoclasti è quella di assorbire sia la componente minerale di idrossiapatite che la matrice organica dell’osso, generando l’aspetto caratteristico del riassorbimento sulla superficie delle ossa. Ci sono relativamente pochi osteoclasti rispetto ad altre cellule del corpo, soprattutto nelle ossa adulte. Studi recenti si sono concentrati su come ottenere osteoclasti più maturi in meno tempo, che è sempre stato un problema. Diversi miglioramenti nelle tecniche di isolamento e cultura si sono sviluppati nei laboratori al fine di ottenere osteoclasti più maturi. Qui, introduciamo un metodo che isola il midollo osseo in meno tempo e con meno sforzo rispetto alla procedura tradizionale, utilizzando un dispositivo speciale e semplice. Con l’uso di centrifugazione a gradiente di densità, otteniamo grandi quantità di osteoclasti completamente differenziati dal midollo osseo del ratto, che sono identificati con metodi classici.
L’omeostasi ossea è un processo fisiologico complesso che è regolato da osteoclasti di riassorbimento osseo e osteoblast che formano ossa1. Un equilibrio tra attività osteoblastica e osteoclastica mediata attraverso osteoblasti e osteoclasti, rispettivamente, è altamente essenziale per mantenere la salute ossea e l’omeostasi, perché le perturbazioni nell’omeostasi ossea possono portare a malattie ossee, come come crescita ossea anormale o perdita di densità ossea. Come cellule di riassorbimento osseo uniche, gli osteoclasti sono importanti nelle malattie legate alla distruzione ossea anormale, tra cui l’osteoporosi, la parodontite e l’osteolisi periprotesica2,3.
Lo sviluppo di una cultura osteocultima è diviso principalmente in due fasi. I metodi stabiliti da Boyde et al.4 e Chambers et al.5 hanno composto la prima tappa negli anni ottanta. Hanno ottenuto osteoclasti relativamente abbondanti dalle ossa degli animali appena nati, che è il periodo di rimodellamento rapido. Gli osteoclasti vengono rilasciati frammentare e mescolare le ossa in un mezzo speciale. Tuttavia, le cellule ottenute con questo metodo sono a basso contenuto di quantità e purezza. Il secondo stadio è stato lo sviluppo di colture a lungo raggio di formazione di degli osteoclasti, utilizzando cellule di lignaggio ematopoietiche derivate dal midollo osseo6. Le citochines, come 1 α, 25-diidrossiamina D3, prostaglandina E2 (PGE-2), e l’ormone paratiroideo (PTH), che vengono aggiunti nel mezzo di coltura, agiscono attraverso il sistema di osteoblasti/cellule stromali per stimolare la formazione di degli osteoclasti7,8 . Tuttavia, la purezza e la quantità degli osteoclasti ottenuti con questo metodo non possono soddisfare le esigenze della moderna ricerca sulla biologia molecolare. Quindi, la scoperta del fattore stimolante le colonie di macrofage (m-CSF) e dell’attivatore del recettore per il ligando del fattore nucleare-κB (RANKL) rende l’osteoclastogenesi più facile9,10,11e il metodo di utilizzo di m-CSF e RANKL per stimolare direttamente la formazione di degli osteoclasti è ampiamente usato in tutto il mondo. Tuttavia, ci sono ancora alcuni dettagli nella metodologia che devono essere migliorate.
Attualmente, il metodo di coltura degli osteoclasti più comunemente usato, come descritto da Marino et al.12 e Pei et al.13, spesso richiede la rimozione del tessuto circostante intorno all’osso e utilizza un ago sterilizzato per lavare la cavità del midollo con supporti completati. Ci sono alcuni inconvenienti a questo processo, compreso il fatto che (1) la rimozione del tessuto circostante intorno all’osso richiede molto tempo e grande tecnica chirurgica, (2) le ossa sono fragili e possono portare a deflusso del midollo osseo, (3) la cavità del midollo osseo potrebbe essere troppo piccolo per lavare, e (4) c’è il rischio di lesioni dell’ago. Per evitare questi problemi, centrifugheremo i tubi contenenti le ossa per il midollo osseo invece di lavare l’ago al midollo osseo. Qui, introduciamo un metodo stabile e sicuro che isola il midollo osseo in meno tempo e con meno sforzo rispetto alla procedura tradizionale. Insieme all’uso della centrifugazione con gradiente di densità, otteniamo grandi quantità di osteoclasti completamente differenziati in vitro.
La capacità di ottenere e studiare osteoclasti in vitro è un’abilità critica e fondamentale per qualsiasi ricercatore che desideri studiare il metabolismo osseo, che può aiutare a comprendere i meccanismi delle malattie che assorbono le ossa e sviluppare nuovi agenti terapeutici. Il presente studio ha descritto un protocollo con alcune modifiche basate su metodi precedenti.
Utilizzando puntali per pipette e provette per microcentrifuga per ottenere il midollo osseo, ha ridotto in gran part…
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione nazionale di scienze naturali della Cina (81473692) a Yong ma. Gli autori ringraziano tutto il personale del centro di ricerca medica del primo collegio di medicina clinica presso l’Università di medicina cinese di Nanchino.
Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
Automatic Hard Tissue Slicer | Lecia | RM2265 | |
Bovine femoral bone | Purchased by ourselves | ||
Cell Incubator | Heraus | BB16/BB5060 | |
Fetal Bovine Serum | Sarana | s-fbs-au-015 | |
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150077 | |
Hard Tissue Grinders | Lecia | SP-2600 | |
Histopaque Kit | TianJing Haoyang | TBD2013DR | Silicified centrifugal tube amd cell separation solution |
Hochest33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | |
Inverted Phase Contrast Microscope | Olympus | CKX31 | |
Inverted Fluorescence Microscope | Lecia | DMI-3000 | |
MEM, no Glutamine | Gibco | 11090-081 | |
Penicillin-Streptomycin, Liquid | Gibco | 15140122 | |
Rabbit Anti-Calcitonin receptor | Bioss | bs-0124R | |
Recombinant Rat M-CSF | PeproTech | 400-28 | |
Recombinant Rat sRANK Ligand | PeproTech | 400-30 | |
Red Blood Cell Lysis Buffer | Absin | abs47014932 | |
Scanning Electron Microscopy | FEI | Quanta 200 | |
Toluidine Blue | Sigma-Aldrich | 89649 |