العظم والعظام هي الانسجه الخاصة الضامة الكريات العظمية المشتقة من سلاله أحاديه الضامة من الخلايا الجذعية التي تكون الدم. يصف هذا البروتوكول كيفيه عزل خلايا نخاع العظم بحيث يتم الحصول علي كميات كبيره من العظم العظمي مع الحد من مخاطر الحوادث الموجودة في الطرق التقليدية.
العظم والعظام هي الخلايا الكبيرة ، نوى ، والعظم-ارتشاف السلالة الاحاديه الضامة التي تتشكل من خلال انصهار البويضات الاحاديه أو السلائف الضامة. ارتشاف العظم المفرط هو واحد من أهم أليات الخلوية التي تؤدي إلى امراض العظم ، بما في ذلك هشاشة العظام ، التهاب اللثة ، وانحلال العظم الاصطناعي. تتمثل الوظيفة الفسيولوجية الرئيسية للعظام في امتصاص كل من مكون هيدروكسيباتيت المعدني والمصفوفة العضوية للعظام ، مما يولد مظهر الارتشاف المميز علي سطح العظام. هناك عدد قليل نسبيا من العظم العظمي بالمقارنة مع الخلايا الأخرى في الجسم ، وخاصه في عظام الكبار. وقد ركزت الدراسات الاخيره علي كيفيه الحصول علي أكثر نضجا العظام في وقت اقل ، والتي كانت دائما مشكله. وقد تطورت العديد من التحسينات في تقنيات العزلة والثقافة في المختبرات من أجل الحصول علي أكثر نضجا العظام. هنا ، ونحن نقدم طريقه التي يعزل نخاع العظم في وقت اقل ومع اقل جهد مقارنه مع الاجراء التقليدي ، وذلك باستخدام جهاز خاص وبسيط. مع استخدام طرد التدرج الكثافة ، ونحن الحصول علي كميات كبيره من العظام متمايزة تماما من نخاع العظم الفئران ، والتي يتم تحديدها بواسطة الأساليب الكلاسيكية.
التوازن العظام هو عمليه الفسيولوجية المعقدة التي ينظمها العظم resorbing العظام والعظام تشكيل عظم1. التوازن بين النشاط العظمي والعظام التي توسطت من خلال عظم والعظم ، علي التوالي ، هو ضروري للغاية للحفاظ علي صحة العظام والتوازن ، وذلك لان الاضطرابات في التوازن العظام قد يؤدي إلى امراض العظام ، مثل كما غير طبيعي نمو العظام أو فقدان كثافة العظام. كخلايا ارتشاف العظام الفريدة من نوعها ، فان العظم الكبدي مهم في الامراض المتعلقة بتدمير العظام غير الطبيعي ، بما في ذلك ترقق العظم ، والتهاب اللثة ، وانحلال العظم الاصطناعي2،3.
يتم تقسيم تطور الثقافة العظمية بشكل رئيسي إلى مرحلتين. وقد شكلت الأساليب التي وضعتها Boyde et al.4 والدوائر وآخرون5 المرحلة الاولي في الثمانينات من القرن الماضي. انها حصلت علي وفره نسبيا العظم من عظام المواليد الجدد ، والتي هي فتره أعاده عرض السريع. يتم الإفراج عن العظم عن طريق تفتيت وتحريك العظام في وسط خاص. ومع ذلك ، فان الخلايا التي تم الحصول عليها بواسطة هذا الأسلوب منخفضه الكمية والنقاء. وكانت المرحلة الثانية تطوير الثقافات طويلة المدى للتشكيل العظمي ، وذلك باستخدام خلايا السلالة المكونة للدم المستمدة من نخاع العظم6. السايتوكينات ، مثل 1α ، 25-ديهيدروكسيفيتامين D3 ، بروستاستارين E2 (pge-2) ، وهرمون الغدة الدرقية (pge) ، والتي تضاف إلى الوسط الثقافي ، والعمل من خلال نظام الخلايا العظمة/اللحمية لتحفيز تشكيل العظم7،8 . ومع ذلك ، فان نقاء وكميه العظام التي يتم الحصول عليها بواسطة هذه الطريقة لا يمكن ان تلبي احتياجات البحوث البيولوجيا الجزيئية الحديثة. ثم ، اكتشاف عامل التحفيز مستعمره الضامة (م-السائل الدماغي الشوكي) والمنشط مستقبلات لعامل النووية-κb يجند (rankl) جعل العظمية أسهل9،10،11، وطريقه استخدام M-السائل الدماغي الشوكي RANKL لتحفيز مباشره تشكيل العظم يستخدم علي نطاق واسع في جميع انحاء العالم. ومع ذلك ، لا تزال هناك بعض التفاصيل في المنهجية التي تحتاج إلى تحسين.
وفي الوقت الحالي ، فان طريقه الاستزراع العظمي الأكثر استخداما ، كما وصفتها مارينو وآخرون12 و Pei et al.13، غالبا ما تتطلب أزاله الانسجه المحيطة حول العظم وتستخدم ابره معقمه لمسح تجويف النخاع مع وسائل الاعلام المكتملة. هناك بعض العيوب لهذه العملية ، بما في ذلك حقيقة ان (1) أزاله الانسجه المحيطة حول العظام يتطلب الكثير من الوقت والتقنية الجراحية كبيره ، (2) العظام هشه ويمكن ان يؤدي إلى تدفق نخاع العظم ، (3) قد يكون تجويف نخاع العظم صغيره جدا لدافق ، و (4) هناك خطر أصابه ابره العصا. لتجنب هذه المشاكل ، ونحن الطرد المركزي الأنابيب التي تحتوي علي العظام لنخاع العظم بدلا من ابره-تنظيف نخاع العظم. هنا ، ونحن نقدم طريقه مستقره وأمنه التي تعزل نخاع العظم في وقت اقل ومع اقل جهد مقارنه مع الإجراءات التقليدية. مع استخدام طرد التدرج الكثافة ، ونحن الحصول علي كميات كبيره من العظام متمايزة تماما في المختبر.
القدرة علي الحصول علي ودراسة العظم الكبدي في المختبر هو مهارة حاسمه وأساسيه لأي باحث يرغب في دراسة استقلاب العظام ، والتي قد تساعد علي فهم أليات الامراض التي تمتص العظام وتطوير العوامل العلاجية الجديدة. وقد وصفت هذه الدراسة بروتوكولا مع بعض التعديلات استنادا إلى الأساليب السابقة.
<p class=…The authors have nothing to disclose.
وقد دعم هذا العمل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81473692) إلى يونغ ما. ويشكر المؤلفون جميع موظفي مركز البحوث الطبية في الكلية الاولي للطب السريري في جامعه نانجينغ للطب الصيني.
Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
Automatic Hard Tissue Slicer | Lecia | RM2265 | |
Bovine femoral bone | Purchased by ourselves | ||
Cell Incubator | Heraus | BB16/BB5060 | |
Fetal Bovine Serum | Sarana | s-fbs-au-015 | |
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150077 | |
Hard Tissue Grinders | Lecia | SP-2600 | |
Histopaque Kit | TianJing Haoyang | TBD2013DR | Silicified centrifugal tube amd cell separation solution |
Hochest33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | |
Inverted Phase Contrast Microscope | Olympus | CKX31 | |
Inverted Fluorescence Microscope | Lecia | DMI-3000 | |
MEM, no Glutamine | Gibco | 11090-081 | |
Penicillin-Streptomycin, Liquid | Gibco | 15140122 | |
Rabbit Anti-Calcitonin receptor | Bioss | bs-0124R | |
Recombinant Rat M-CSF | PeproTech | 400-28 | |
Recombinant Rat sRANK Ligand | PeproTech | 400-30 | |
Red Blood Cell Lysis Buffer | Absin | abs47014932 | |
Scanning Electron Microscopy | FEI | Quanta 200 | |
Toluidine Blue | Sigma-Aldrich | 89649 |