ラット骨髄からの破骨細胞前駆体の分離・精製・分化
Summary
破骨細胞は、造血幹細胞の単球-マクロファージ系統に由来する組織特異的なマクロファージ polykaryons である。このプロトコルは、従来の方法で見られる事故のリスクを低減しながら、大量の破骨細胞が得られるように骨髄セルを分離する方法を説明する。
Abstract
破骨細胞は、単球またはマクロファージ前駆体の融合によって形成される単球-マクロファージ系統の大規模、多核、および骨瘢痕である。過度の骨吸収は、骨粗鬆症、歯周炎、periprosthetic 骨溶解を含む溶骨性疾患につながる最も重要な細胞機構である。破骨細胞の主な生理機能は、骨のヒドロキシアパタイトミネラル成分と有機マトリックスの両方を吸収し、骨の表面に特徴的な吸収外観を発生させることである。身体の他の細胞と比較して、特に成人の骨において比較的少数の骨細胞がある。最近の研究では、より短時間でより成熟した破骨細胞を得る方法に着目してきましたが、これは常に問題となっています。分離性および培養技術のいくつかの改善は、より成熟した破骨細胞を得るために実験室で開発した。ここでは、従来の手順と比較して、より少ない時間で、より少ない労力で骨髄を分離する方法を、特別でシンプルな装置を使用して導入します。密度勾配遠心分離の使用により、我々は、古典的方法によって同定されるラット骨髄からの完全に分化した破骨細胞を大量に得る。
Introduction
骨恒常性は、骨瘢痕破骨細胞および骨形成性骨芽細胞1によって調節される複雑な生理的過程である。骨芽細胞および破骨細胞を介して媒介される骨芽と osteoclastic 活動との間のバランスは、それぞれ、骨の健康と恒常性を維持するために非常に重要であり、このような骨格恒常性の摂動は骨疾患につながる可能性があるため、異常な骨の成長または骨密度の損失として.ユニークな骨吸収細胞としては、骨粗しょう症、歯周炎、periprosthetic 骨溶解2,3などの異常骨折に関連する疾患に重要です。
破骨細胞の培養の開発は、主に2つの段階に分けられる。Boyde et al.4およびチェンバース et al.5によって確立された方法は、1980年代の第一段階を構成した。彼らは急速なリモデリング期間である新生動物の骨から比較的豊富な破骨細胞を得た。破骨細胞は、特殊な培地で骨を攪拌して断片化することによって放出される。しかし、この方法によって得られる細胞は、量および純度が低い。第2段階では、骨髄破骨細胞由来の造血器系統を用いて、細胞骨格形成の長期培養物の開発を行いました。サイトカインは、例えば、1α、25−ジヒドロキシビタミン D3、プロスタグランジン E2 (pge2)、および副甲状腺ホルモン (PTH)、培養培地に添加された、破骨細胞/ストロマセルの系を通じて作用して、細胞芽層形成を刺激する7,8.しかしながら、この方法によって得られた破骨細胞の純度と量は、現代の分子生物学研究のニーズを満たすことができない。次いで、核因子-κ b リガンド (RANKL) のためのマクロファージコロニー刺激因子 (M − csf) および受容体活性化剤の発見は、osteoclastogenesis をより容易にし、そして、M − CSF を使用する方法および破骨細胞の形成を直接刺激する RANKL は、世界中で広く使用されている。しかし、改善する必要がある方法論にはまだいくつかの詳細があります。
現在、最も一般的に使用されている破骨細胞培養法は、マリノ et al.12および Pei et al.13で説明したように、しばしば骨の周りの周囲の組織の除去を必要とし、滅菌された針を使用して骨髄腔をフラッシュする完成したメディア。(1) 骨の周りの周囲の組織の除去が多くの時間と偉大な外科的技術を必要とするという事実を含め、このプロセスにはいくつかの欠点があり、(2) 骨が壊れやすく、骨髄流出につながる可能性がある、(3) 骨髄腔はフラッシュするには小さすぎると、(4) 針のスティック傷害の危険性があります。これらの問題を回避するために、骨髄を針で洗い流す代わりに、骨髄用の骨を含むチューブを遠心分離します。ここでは、従来の手順と比較して、より短時間でより少ない労力で、骨髄を分離する安定した安全な方法を紹介します。遠心分離の密度勾配の使用とともに、我々は、インビトロで大量に分化した破骨細胞を得る。
Protocol
Representative Results
Discussion
インビトロで破骨細胞を得、研究する能力は、骨代謝を研究したい研究者にとって重要かつ基礎的な技術であり、骨吸収疾患のメカニズムを理解し、新しい治療薬を開発するのに役立つ可能性がある。本研究は、以前の方法に基づくいくつかの変更を伴うプロトコルについて説明した。
マイクロ遠心を使用することにより、骨髄を取得するためにピペットの先端および?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、中国の国立自然科学財団 (81473692) にヨン・マによって支えられました。著者は、南京中国医学大学の臨床医学の最初の大学の医学研究センターのすべてのスタッフに感謝します.
Materials
| Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
| Automatic Hard Tissue Slicer | Lecia | RM2265 | |
| Bovine femoral bone | Purchased by ourselves | ||
| Cell Incubator | Heraus | BB16/BB5060 | |
| Fetal Bovine Serum | Sarana | s-fbs-au-015 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150077 | |
| Hard Tissue Grinders | Lecia | SP-2600 | |
| Histopaque Kit | TianJing Haoyang | TBD2013DR | Silicified centrifugal tube amd cell separation solution |
| Hochest33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | |
| Inverted Phase Contrast Microscope | Olympus | CKX31 | |
| Inverted Fluorescence Microscope | Lecia | DMI-3000 | |
| MEM, no Glutamine | Gibco | 11090-081 | |
| Penicillin-Streptomycin, Liquid | Gibco | 15140122 | |
| Rabbit Anti-Calcitonin receptor | Bioss | bs-0124R | |
| Recombinant Rat M-CSF | PeproTech | 400-28 | |
| Recombinant Rat sRANK Ligand | PeproTech | 400-30 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Absin | abs47014932 | |
| Scanning Electron Microscopy | FEI | Quanta 200 | |
| Toluidine Blue | Sigma-Aldrich | 89649 |
References
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