Sıçan kemik Iliği Osteoclast precursors yalıtım, arıtma ve farklılaşma
Summary
Osteokuzlar, hematopoetik kök hücrelerin monosit-makrophaj soylarından elde edilen dokuya özgü makrophaj polykaryonlarındadır. Bu protokol, kemik iliği hücrelerinin nasıl yalıtılmasını açıklar, böylece geleneksel yöntemlerde bulunan kazaların riskini azaltarak büyük miktarlarda osteocsürer elde edilir.
Abstract
Osteositler, monosit veya makrophaj öncülerinin birleşerek oluşturduğu monoksit-makrophaj sırının büyük, multinükleated ve kemik-resorbing hücrelerdir. Aşırı kemik reorpsiyonu osteolitik hastalıklara yol açan en önemli hücresel mekanizmalardan biridir, osteoporoz dahil, periodontitis, ve periprotez Osteoliz. Osteocsürer ana fizyolojik fonksiyon hem hidroksiatit mineral bileşeni ve kemik organik matris absorbe, kemik yüzeyinde karakteristik reorpsiyon görünümünü üreten. Vücudun diğer hücrelerine kıyasla nispeten az osteocsürer, özellikle yetişkin kemiklerde. Son çalışmalar her zaman bir sorun olmuştur daha az zaman, daha olgun osteocsürer elde etmek için nasıl odaklanmıştır. İzolasyon ve kültür tekniklerinde çeşitli iyileştirmeler daha olgun osteocsürer elde etmek için laboratuvarlarda geliştirdik. Burada, özel ve basit bir cihaz kullanarak, daha az zaman içinde kemik iliği yalıtır ve geleneksel prosedür ile karşılaştırıldığında daha az çaba ile bir yöntem tanıtmak. Yoğunluk degrade santrifüjleme kullanımı ile, biz klasik yöntemlerle tanımlanır sıçan kemik iliği, tam farklılaşmış osteocsürer büyük miktarda elde.
Introduction
Kemik homeostazisi, kemik-reorbing osteoksürer ve kemik oluşturan osteoblastlar1ile düzenlenmiş karmaşık bir fizyolojik süreçtir. Osteoblastlar ve osteocsürer ile aracılı osteoblastik ve osteoklastik aktivite arasında bir denge, sırasıyla, kemik sağlığı ve homeostaz korumak için son derece önemlidir, çünkü kemik homeostazı perturbations kemik hastalıklarına yol açabilir, böyle anormal kemik büyümesi veya kemik yoğunluğu kaybı olarak. Benzersiz kemik-reorpsiyon hücreleri olarak, osteocsürer anormal kemik imha ile ilgili hastalıklarda önemlidir, osteoporoz dahil, periodontitis, ve periprotez Osteoliz2,3.
Osteoklast kültürünün gelişimi ağırlıklı olarak iki aşamaya ayrılır. Boyde et al.4 ve Chambers ve al.5 tarafından kurulan Yöntemler 1980 ‘ lerde ilk aşamadan oluşuyor. Hızlı remodeling dönemi olan yenidoğan hayvanların kemiklerinden nispeten bol miktarda osteocsürer elde ettiler. Osteocsürer, özel bir ortamda kemikleri birleştirerek ve karıştırarak serbest bırakılır. Ancak, bu yöntem tarafından elde edilen hücreler miktarı ve saflık düşüktür. İkinci aşama, kemik iliği6‘ dan elde edilen hematopoetik soy hücrelerini kullanarak, osteoklast oluşumunun uzun menzilli kültürlerinin gelişmedir. Sitokinler, 1α gibi, 25-dihidroxyvitamin D3, prostaglandin E2 (PGE-2), ve Paratiroid hormonu (PTH), hangi kültür ortamına eklenir, osteoblastlar sistemi aracılığıyla hareket/stromal hücreler osteoklast oluşumu uyarmak için7,8 . Ancak, bu yöntemle elde edilen osteocsürer saflık ve miktarı modern moleküler biyoloji araştırmalarının ihtiyaçlarını karşılamaz. Sonra, makrofaj koloni uyarıcı faktörü (M-CSF) ve reseptör aktivatörü nükleer Factor-κB ligand (rankl) keşfi daha kolay osteoclastogenesis yapmak9,10,11, ve M-CSF ve kullanma yöntemi RANKL doğrudan osteoklast oluşumu uyarmak için yaygın olarak dünya çapında kullanılır. Ancak, hala iyileştirilmesi gereken metodoloji bazı detaylar vardır.
Şu anda, en sık kullanılan osteoklast kültür yöntemi, Marino ve al.12 ve Pei et al.13tarafından açıklandığı gibi, genellikle kemik çevresindeki çevreleyen doku kaldırılması gerektirir ve ile iliği boşluğu temizlemek için sterilize iğne kullanır tamamlanmış medya. Bu süreçte bazı dezavantajları vardır, (1) kemik etrafında çevreleyen doku kaldırılması çok zaman ve büyük cerrahi tekniği gerektirir, (2) kemikler kırılgan ve kemik iliği çıkışı yol açabilir, (3) kemik iliği boşluğu olabilir floş için çok küçük ve (4) iğne sopa yaralanma riski vardır. Bu sorunlardan kaçınmak için, kemik iliği yerine kemik iliğinin kemikleri içeren tüpleri santrifüjler. Burada, daha az zamanda ve geleneksel prosedür ile karşılaştırıldığında daha az çaba ile kemik iliği yalıtır istikrarlı ve güvenli bir yöntem tanıtmak. Yoğunluk degrade santrifüjleme kullanımı ile birlikte, tam farklılaşmış osteocsürer in vitro büyük miktarlarda elde.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kemik emici hastalıkların mekanizmalarını anlamanıza ve yeni terapötik ajanlar geliştirmesine yardımcı olabilecek kemik metabolizmasını incelemek isteyen herhangi bir araştırmacı için osteocsürer in vitro elde etme ve çalışma becerisi, önemli ve temel bir beceridir. Bu çalışmada, önceki yöntemlere dayalı bazı değişikliklerle ilgili bir protokol tanımlanmıştır.
Kemik iliği elde etmek için pipet uçları ve mikrosantrifüj tüpleri kullanarak, büyük ölçüde…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Çin Ulusal Doğal Bilim Vakfı (81473692) tarafından Yong ma için desteklenmektedir. Yazarlar Çin tıp Nanjing Üniversitesi Klinik Tıp Ilk Koleji Tıp Araştırma Merkezi tüm personel teşekkür ederiz.
Materials
| Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
| Automatic Hard Tissue Slicer | Lecia | RM2265 | |
| Bovine femoral bone | Purchased by ourselves | ||
| Cell Incubator | Heraus | BB16/BB5060 | |
| Fetal Bovine Serum | Sarana | s-fbs-au-015 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150077 | |
| Hard Tissue Grinders | Lecia | SP-2600 | |
| Histopaque Kit | TianJing Haoyang | TBD2013DR | Silicified centrifugal tube amd cell separation solution |
| Hochest33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | |
| Inverted Phase Contrast Microscope | Olympus | CKX31 | |
| Inverted Fluorescence Microscope | Lecia | DMI-3000 | |
| MEM, no Glutamine | Gibco | 11090-081 | |
| Penicillin-Streptomycin, Liquid | Gibco | 15140122 | |
| Rabbit Anti-Calcitonin receptor | Bioss | bs-0124R | |
| Recombinant Rat M-CSF | PeproTech | 400-28 | |
| Recombinant Rat sRANK Ligand | PeproTech | 400-30 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Absin | abs47014932 | |
| Scanning Electron Microscopy | FEI | Quanta 200 | |
| Toluidine Blue | Sigma-Aldrich | 89649 |
References
- Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).
- Kular, J., Tickner, J., Chim, S. M., Xu, J. K. An overview of the regulation of bone remodelling at the cellular level. Clinical Biochemistry. 45 (12), 863-873 (2012).
- Park, S. J., et al. Apoptosis of the reduced enamel epithelium and its implications for bone resorption during tooth eruption. Journal Of Molecular Histology. 44 (1), 65-73 (2013).
- Boyde, A., Ali, N. N., Jones, S. J. Resorption of dentine by isolated osteoclasts in vitro. British Dental Journal. 156 (6), 216-220 (1984).
- Chambers, T. J., Revell, P. A., Fuller, K., Athanasou, N. A. Resorption of bone by isolated rabbit osteoclasts. Journal of Cell Science. 66, 383-399 (1984).
- Takahashi, N., et al. Osteoclast-like cell formation and its regulation by osteotropic hormones in mouse bone marrow cultures. Endocrinology. 122 (4), 1373-1382 (1988).
- Takahashi, N., et al. Osteoblastic cells are involved in osteoclast formation. Endocrinology. 123 (5), 2600-2602 (1988).
- Suda, T., Takahashi, N., Martin, T. J. Modulation of osteoclast differentiation. Endocrine Reviews. 13 (1), 66-80 (1992).
- Yoshida, H., et al. The murine mutation osteopetrosis is in the coding region of the macrophage colony stimulating factor gene. Nature. 345 (6274), 442-444 (1990).
- Yasuda, H., et al. Osteoclast differentiation factor is a ligand for osteoprotegerin/osteoclastogenesis-inhibitory factor and is identical to TRANCE/RANKL. Proceedings of The National Academy of Sciences of The United States of America. 95 (7), 3597-3602 (1998).
- Lacey, D. L., et al. Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation. Cell. 93 (2), 165-176 (1998).
- Marino, S., Logan, J. G., Mellis, D., Capulli, M. Generation and culture of osteoclasts. BoneKEy Reports. 3, 570 (2014).
- Pei, J. R., et al. Fluoride decreased osteoclastic bone resorption through the inhibition of NFATc1 gene expression. Environmental Toxicology. 29 (5), 588-595 (2014).
- Arnett, T. R., Dempster, D. W. Effect of pH on bone resorption by rat osteoclasts in vitro. Endocrinology. 119 (1), 119-124 (1986).
- Arnett, T. R., et al. Hypoxia is a major stimulator of osteoclast formation and bone resorption. Journal of Cellular Physiology. 196 (1), 2-8 (2003).
- Orriss, I. R., Arnett, T. R. Rodent osteoclast cultures. Methods in Molecular Biology. 816, 103-117 (2012).
- Quinn, J. M., et al. Calcitonin receptor antibodies in the identification of osteoclasts. Bone. 25 (1), 1-8 (1999).
