Præsenteret her er en protokol, der kombinerer en in vitro neurale-Endothelial Co-kultur system og metabolisk inkorporering af sialoglycan med bioorthogonal funktionelle grupper til at udvide primære neurale stamme og stamcelle celler og mærke deres overflade sialoglycoproteiner til billeddannelse eller massespektrometri analyse af celleoverflade markører.
Neurale stamme-og stamceller (Nspc’er) er det cellulære grundlag for de komplekse strukturer og funktioner i hjernen. De er placeret i specialiserede nicher in vivo og kan isoleres og udvides in vitro, tjener som en vigtig ressource for celletransplantation til at reparere hjerneskade. Nspc’erne er imidlertid heterogene og ikke klart defineret på molekyleniveau eller renset på grund af manglende specifikke celleoverflade markører. Den forelagte protokol, som tidligere er blevet rapporteret, kombinerer et Neural-Endothelial Co-Culture system med en metabolisk Les mærkningsmetode til at identificere overfladen sialoglycoproteome af primære nspc’er. Det NSPC-endotheliale Co-kultur system giver mulighed for selvfornyelse og udvidelse af primære Nspc’er in vitro, genererer et tilstrækkeligt antal nspc’er. Sialoglycans i dyrkede nspc’er er mærket ved hjælp af en unaturlig sialisyre metabolisk reporter med bioorthogonal funktionelle grupper. Ved at sammenligne sialoglycoproteomet fra selvfornyende Nspc’er ekspanderet i en endotelco-kultur med differentierende neurale kultur, identificerer vi en liste over membran proteiner, der er beriget i Nspc’er. I detaljer omfatter protokollen: 1) oprettelse af en NSPC-Endothelial Co-kultur og NSPC differentierende kultur; 2) mærkning med azidosugar per-O-acetyleret N-azidoacetylmannosamin (AC4Mannaz); og 3) biotin konjugering til modificeret sialoglycan til billeddannelse efter fiksering af neurale kultur eller protein udvinding fra neurale kultur for massespektrometri analyse. Derefter udvælges de NSPC-berigede overflade markør kandidater ved komparativ analyse af massespektrometri data fra både det udvidede NSPC og differentierede neurale kulturer. Denne protokol er meget følsom for at identificere membran proteiner af lav overflod i udgangsmaterialerne, og det kan anvendes til markør opdagelse i andre systemer med passende ændringer
Neurale stamceller er defineret som en multi potent cellepopulation, der kan selv forny for at opretholde en stamcelle pulje og differentiere sig til neuroner og glia. De er de vigtigste celletyper i nervesystemet og kan tilbyde stort terapeutisk potentiale i regenerativ medicin gennem celletransplantation til syge og sårede hjerner1,2. Efterhånden som udviklingen skrider frem, bliver den neurale stamcelle population heterogene3,4, og andelen af neurale stamceller i hjernen aftager gradvist5. Generelt er embryonale neurale stamceller og andre neurale stamceller, kollektivt kaldet neurale stamme-og progenitorceller (Nspc’er), placeret i avlsmateriale zonerne, ventrikel zonen og den subventrikulære zone i mus6. I den embryonale hjerne genererer neurale stamceller neuroner direkte eller indirekte gennem mellemliggende progenitorceller (IPCS) og i nogle arter gennem den ydre subventrikulære zone forfædre (orgs)7,8. Den specifikke molekylære signatur, morfologi, placering i stamcelle niche, og differentiering potentiale alle bestemme rollen for hver under type i hjernen organogenesen og kliniske anvendelser9. De aktuelt tilgængelige celleoverflade markører kan dog ikke utvetydigt diskriminere og rense forskellige undertyper af Nspc’er, hvilket begrænser forståelsen og udnyttelsen af disse undertyper.
Identifikationen af primære Nspc’er overflade markører er begrænset af tre store forhindringer. Den første er det begrænsede celleantal af Nspc’er i vævet, hvilket gør det vanskeligt at forberede celleoverflade protein prøver til almindelig massespektrometri analyse. Den anden begrænsning er vanskeligheden ved at producere rene celle undertyper til generering af subtype-specifikke membran protein data. Endelig er den tredje udfordring det lave forhold mellem celleoverflade proteiner i hele celle proteiner, som hæmmer deres detekteringsfølsomhed ved massespektrometri analyse.
For at overvinde disse problemer, vi udviklet en chemoproteomic tilgang til selektivt berige og identificere celleoverflade proteiner i primære Nspc’er ved metabolisk mærkning af sialoglycoproteiner10. For at generere et tilstrækkeligt antal Nspc’er benyttede vi en etableret protokol til at udvide og vedligeholde primære embryonale Nspc’er i udifferentierede stater in vitro, ved at co-culturing Nspc’er med musehjerne endotheliale cellelinjer ved hjælp af en permeabel støtte matrix indsats (f. eks. transwell) system11. I modsætning hertil genererer npscs, som dyrkes alene uden endotelceller, differentieret afkom11,12. Således kan protein prøver fra disse to kultur systemer relativt analyseres for at identificere proteiner, der differentielt udtrykkes i Nspc’er og differentierede neuroner. Da de fleste celleoverflade proteiner modificeres af sialsyre13, blev unaturlig sialsyre forløber analogt N-azidoacetylmannosamin-tetraacyleret (AC4Mannaz) anvendt til at kapre den iboende metaboliske pathway, således at endogene, nyligt syntetiseret sialoglycans er mærket med azido grupper, genererer en kemisk håndtag14. Gennem azido-alkyne-medierede bioortogonale reaktioner, som konjugat biotin til sialoglycans, kan celleoverflade proteiner visualiseres og beriges til proteomisk identifikation gennem en streptavidin-koblet fluoroforet eller matrix14.
Her udfører vi farvning af SDS-side gel analyse af overfladen sialoglycoproteome fra nspc’er ekspanderet i en endotel Co-kultur og differentiere celler i et ikke-Co-kultur system. Vi renser også selektivt overflade sialoglycoproteome i de to kultur systemer til proteomisk sammenligning. Vores protokol, sammenlignet med de traditionelle Centrifugerings baserede celleoverflade rensning protokoller15, øger ekstraktions effekten ved at reducere overfladen protein udvinding procedurer gennem specifik tag konjugation og affinitet Rensning. I mellemtiden, det øger udvinding renhed af celleoverflade proteiner baseret på den forudsætning, at sialylering sker mest på celleoverfladen proteiner. Selv om endotelfaktorer ikke helt kan blokere differentieringen af ekspanderede Nspc’er, giver den komparative undersøgelse mellem en co-kultur og differentieret kultur en bekvem metode til at lokalisere stamcelle berigede overflade proteiner, uden at det er nødvendigt at Analysér proteiner fra NPC’er renset af FACS16. Vi mener, at denne fremgangsmåde kan anvendes til undersøgelser af overflade proteiner i andre systemer med passende modifikationer.
Overflade markører bruges almindeligvis til at mærke og rense specifikke celletyper in vitro og in vivo17,18. Opdagelsen af overflade markører bidrager i høj grad til regenerativ medicin og stamcelleforskning ved at give molekylære værktøjer til selektivt at berige en stamcelle population fra normale eller patologiske væv og kultur retter, der tilbyder en renset celle ressource til klinisk brug eller undersøgelse af biologiske egenskaber. Men fremskridte…
The authors have nothing to disclose.
Figur 1b, 1C, 1E og 1f gengives fra Bai et al . 10 med tilladelse fra Royal Society of Chemistry. Vi takker Yi Hao i X. C. ‘s Lab for figur redigering. Dette arbejde støttes af Kinas National Natural Science Foundation (nr. 91753206 til Q. S. og X. C., nr. 31371093 til Q. S., og NOS. 21425204 og 21672013 til X. C.).
BEND3 | ATCC | CRL-229 | |
DMEM | Gibco | 11960044 | |
L-glutamine | Gibco | 25030081 | 1% |
Sodium pyruvate | Sigma | P5280 | 1% |
N2 supplement | Gibco | 17502048 | 1 to 100 |
N-acetyl-L-cysteine | Sigma | A7250 | 1 mM |
Papain | Worthington | LS003726 | 10 U/mL |
B27 supplement | Gibco | 17504044 | 1 to 50 |
Poly-L-lysine | Sigma | P4707 | |
basic Fibroblast growth factor | Gibco | PHG0261 | 10 ng/mL |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | 1% |
Fetal bovine serum | Gibco | 10099141 | 10% |
HBSS | Gibco | 14175095 | |
Tripsin-EDTA, 0.25% | Gibco | 25200056 | |
DPBS | Gibco | 14190094 | |
Transwell | Corning | 3450 | |
Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | 4% |
Sucrose | Sangon | A100335 | |
DAPI | Gibco | 62248 | |
RIPA buffer | Thermo Scientific | 89900 | |
SDS-PAGE loading buffer 2X | Solarbio | P1018 | |
6-well plate | Corning | 3335 | |
Tris-Glycine protein gel | invitrogen | xp00100box | |
mouse monoclonal anti-Nestin | Developmental Study Hybridoma Bank | Rat-401 | 1 to 20 |
mouse monoclonal anti-beta-tubulin III | Sigma | T8860 | 1 to 1000 |
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1 | invitrogen | A-21121 | 1 to 1000 |
Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG2b | invitrogen | A-21143 | 1 to 1000 |
Albumin Bovine V | Amresco | 0332 | |
Triton X-100 | Amresco | 0694 | |
BCA assay kit | Thermo Scientific | 23225 | |
dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
Brij97 | Aladdin | B129088 | |
CuSO4 | Sigma | 209198 | |
alkyne-biotin | Click Chemistry Tools | TA105 | |
BTTAA | Click Chemistry Tools | 1236 | |
Ac4ManNAz | Click Chemistry Tools | 1084 | 100 µM |
9AzSia | synthesized in lab | ||
sodium ascorbate | Sigma | A4034 | |
Methanol | Sigma | 34860 | |
EDTA | Sangon | A100322 | |
NaCl | Sangon | A100241 | |
SDS | Sangon | A100227 | |
Alexa Flour 647-conjugated streptavidin | invitrogen | S21374 | 1 to 1000 |
Triethanolamine | Sigma | V900257 | |
Dynabeads M-280 Streptavidin | invitrogen | 60210 | |
ammonium bicarbonate | Sigma | 9830 | |
Coomassie Brilliant Blue R-250 | Thermo Scientific | 20278 | |
Isoflurane | RWD Life Science Co. | 970-00026-00 | |
DNase I | Sigma | DN25 | 12 µg/mL |
urea | Sigma | U5378 |