Identifikation af celleoverflade markører for primær neurale stamme og stamceller ved metabolisk mærkning af Sialoglycan

Summary

Præsenteret her er en protokol, der kombinerer en in vitro neurale-Endothelial Co-kultur system og metabolisk inkorporering af sialoglycan med bioorthogonal funktionelle grupper til at udvide primære neurale stamme og stamcelle celler og mærke deres overflade sialoglycoproteiner til billeddannelse eller massespektrometri analyse af celleoverflade markører.

Abstract

Neurale stamme-og stamceller (Nspc’er) er det cellulære grundlag for de komplekse strukturer og funktioner i hjernen. De er placeret i specialiserede nicher in vivo og kan isoleres og udvides in vitro, tjener som en vigtig ressource for celletransplantation til at reparere hjerneskade. Nspc’erne er imidlertid heterogene og ikke klart defineret på molekyleniveau eller renset på grund af manglende specifikke celleoverflade markører. Den forelagte protokol, som tidligere er blevet rapporteret, kombinerer et Neural-Endothelial Co-Culture system med en metabolisk Les mærkningsmetode til at identificere overfladen sialoglycoproteome af primære nspc’er. Det NSPC-endotheliale Co-kultur system giver mulighed for selvfornyelse og udvidelse af primære Nspc’er in vitro, genererer et tilstrækkeligt antal nspc’er. Sialoglycans i dyrkede nspc’er er mærket ved hjælp af en unaturlig sialisyre metabolisk reporter med bioorthogonal funktionelle grupper. Ved at sammenligne sialoglycoproteomet fra selvfornyende Nspc’er ekspanderet i en endotelco-kultur med differentierende neurale kultur, identificerer vi en liste over membran proteiner, der er beriget i Nspc’er. I detaljer omfatter protokollen: 1) oprettelse af en NSPC-Endothelial Co-kultur og NSPC differentierende kultur; 2) mærkning med azidosugar per-O-acetyleret N-azidoacetylmannosamin (AC₄Mannaz); og 3) biotin konjugering til modificeret sialoglycan til billeddannelse efter fiksering af neurale kultur eller protein udvinding fra neurale kultur for massespektrometri analyse. Derefter udvælges de NSPC-berigede overflade markør kandidater ved komparativ analyse af massespektrometri data fra både det udvidede NSPC og differentierede neurale kulturer. Denne protokol er meget følsom for at identificere membran proteiner af lav overflod i udgangsmaterialerne, og det kan anvendes til markør opdagelse i andre systemer med passende ændringer

Introduction

Neurale stamceller er defineret som en multi potent cellepopulation, der kan selv forny for at opretholde en stamcelle pulje og differentiere sig til neuroner og glia. De er de vigtigste celletyper i nervesystemet og kan tilbyde stort terapeutisk potentiale i regenerativ medicin gennem celletransplantation til syge og sårede hjerner^1,2. Efterhånden som udviklingen skrider frem, bliver den neurale stamcelle population heterogene^3,4, og andelen af neurale stamceller i hjernen aftager gradvist⁵. Generelt er embryonale neurale stamceller og andre neurale stamceller, kollektivt kaldet neurale stamme-og progenitorceller (Nspc’er), placeret i avlsmateriale zonerne, ventrikel zonen og den subventrikulære zone i mus⁶. I den embryonale hjerne genererer neurale stamceller neuroner direkte eller indirekte gennem mellemliggende progenitorceller (IPCS) og i nogle arter gennem den ydre subventrikulære zone forfædre (orgs)^7,8. Den specifikke molekylære signatur, morfologi, placering i stamcelle niche, og differentiering potentiale alle bestemme rollen for hver under type i hjernen organogenesen og kliniske anvendelser⁹. De aktuelt tilgængelige celleoverflade markører kan dog ikke utvetydigt diskriminere og rense forskellige undertyper af Nspc’er, hvilket begrænser forståelsen og udnyttelsen af disse undertyper.

Identifikationen af primære Nspc’er overflade markører er begrænset af tre store forhindringer. Den første er det begrænsede celleantal af Nspc’er i vævet, hvilket gør det vanskeligt at forberede celleoverflade protein prøver til almindelig massespektrometri analyse. Den anden begrænsning er vanskeligheden ved at producere rene celle undertyper til generering af subtype-specifikke membran protein data. Endelig er den tredje udfordring det lave forhold mellem celleoverflade proteiner i hele celle proteiner, som hæmmer deres detekteringsfølsomhed ved massespektrometri analyse.

For at overvinde disse problemer, vi udviklet en chemoproteomic tilgang til selektivt berige og identificere celleoverflade proteiner i primære Nspc’er ved metabolisk mærkning af sialoglycoproteiner¹⁰. For at generere et tilstrækkeligt antal Nspc’er benyttede vi en etableret protokol til at udvide og vedligeholde primære embryonale Nspc’er i udifferentierede stater in vitro, ved at co-culturing Nspc’er med musehjerne endotheliale cellelinjer ved hjælp af en permeabel støtte matrix indsats (f. eks. transwell) system¹¹. I modsætning hertil genererer npscs, som dyrkes alene uden endotelceller, differentieret afkom^11,12. Således kan protein prøver fra disse to kultur systemer relativt analyseres for at identificere proteiner, der differentielt udtrykkes i Nspc’er og differentierede neuroner. Da de fleste celleoverflade proteiner modificeres af sialsyre¹³, blev unaturlig sialsyre forløber analogt N-azidoacetylmannosamin-tetraacyleret (AC₄Mannaz) anvendt til at kapre den iboende metaboliske pathway, således at endogene, nyligt syntetiseret sialoglycans er mærket med azido grupper, genererer en kemisk håndtag¹⁴. Gennem azido-alkyne-medierede bioortogonale reaktioner, som konjugat biotin til sialoglycans, kan celleoverflade proteiner visualiseres og beriges til proteomisk identifikation gennem en streptavidin-koblet fluoroforet eller matrix¹⁴.

Her udfører vi farvning af SDS-side gel analyse af overfladen sialoglycoproteome fra nspc’er ekspanderet i en endotel Co-kultur og differentiere celler i et ikke-Co-kultur system. Vi renser også selektivt overflade sialoglycoproteome i de to kultur systemer til proteomisk sammenligning. Vores protokol, sammenlignet med de traditionelle Centrifugerings baserede celleoverflade rensning protokoller¹⁵, øger ekstraktions effekten ved at reducere overfladen protein udvinding procedurer gennem specifik tag konjugation og affinitet Rensning. I mellemtiden, det øger udvinding renhed af celleoverflade proteiner baseret på den forudsætning, at sialylering sker mest på celleoverfladen proteiner. Selv om endotelfaktorer ikke helt kan blokere differentieringen af ekspanderede Nspc’er, giver den komparative undersøgelse mellem en co-kultur og differentieret kultur en bekvem metode til at lokalisere stamcelle berigede overflade proteiner, uden at det er nødvendigt at Analysér proteiner fra NPC’er renset af FACS¹⁶. Vi mener, at denne fremgangsmåde kan anvendes til undersøgelser af overflade proteiner i andre systemer med passende modifikationer.

Protocol

Alle de dyre protokoller, der blev anvendt i denne undersøgelse, blev godkendt af IACUC (Udvalget for institutionel dyreomsorg og-anvendelse) på Tsinghua Universitet og udført i overensstemmelse med IACUC’S retningslinjer. Laboratoriet dyre facilitet på Tsinghua Universitet er blevet akkrediteret af AAALAC (Association for vurdering og akkreditering af laboratorium Animal Care International). Til iscenesættelse af embryoner blev midt dagen for det identificerede vaginal stik beregnet som embryon dag 0,5 (E 0,5)….

Representative Results

Hele proceduren for in vitro-ekspansion og metabolisk mærkning af primære embryonale Nspc’er tager 6 dage (figur 1a). Kvaliteten af BEND3 cellelinje og nyisolerede primære Nspc’er er nøglen til et vellykket eksperiment. BEND3 celler er kilden til opløselige faktorer, der stimulerer selvfornyelse og spredning af Nspc’er. Det bør sikres, at de BEND3 celler er fri for enhver kontaminering og opdele aktivt med minimal celledød før Co-culturing med neurale…

Discussion

Overflade markører bruges almindeligvis til at mærke og rense specifikke celletyper in vitro og in vivo^17,18. Opdagelsen af overflade markører bidrager i høj grad til regenerativ medicin og stamcelleforskning ved at give molekylære værktøjer til selektivt at berige en stamcelle population fra normale eller patologiske væv og kultur retter, der tilbyder en renset celle ressource til klinisk brug eller undersøgelse af biologiske egenskaber. Men fremskridte…

Materials

BEND3	ATCC	CRL-229
DMEM	Gibco	11960044
L-glutamine	Gibco	25030081	1%
Sodium pyruvate	Sigma	P5280	1%
N2 supplement	Gibco	17502048	1 to 100
N-acetyl-L-cysteine	Sigma	A7250	1 mM
Papain	Worthington	LS003726	10 U/mL
B27 supplement	Gibco	17504044	1 to 50
Poly-L-lysine	Sigma	P4707
basic Fibroblast growth factor	Gibco	PHG0261	10 ng/mL
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	1%
Fetal bovine serum	Gibco	10099141	10%
HBSS	Gibco	14175095
Tripsin-EDTA, 0.25%	Gibco	25200056
DPBS	Gibco	14190094
Transwell	Corning	3450
Paraformaldehyde	Sigma	158127	4%
Sucrose	Sangon	A100335
DAPI	Gibco	62248
RIPA buffer	Thermo Scientific	89900
SDS-PAGE loading buffer 2X	Solarbio	P1018
6-well plate	Corning	3335
Tris-Glycine protein gel	invitrogen	xp00100box
mouse monoclonal anti-Nestin	Developmental Study Hybridoma Bank	Rat-401	1 to 20
mouse monoclonal anti-beta-tubulin III	Sigma	T8860	1 to 1000
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1	invitrogen	A-21121	1 to 1000
Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG2b	invitrogen	A-21143	1 to 1000
Albumin Bovine V	Amresco	0332
Triton X-100	Amresco	0694
BCA assay kit	Thermo Scientific	23225
dimethyl sulfoxide	Sigma	D2650
Brij97	Aladdin	B129088
CuSO4	Sigma	209198
alkyne-biotin	Click Chemistry Tools	TA105
BTTAA	Click Chemistry Tools	1236
Ac4ManNAz	Click Chemistry Tools	1084	100 µM
9AzSia	synthesized in lab
sodium ascorbate	Sigma	A4034
Methanol	Sigma	34860
EDTA	Sangon	A100322
NaCl	Sangon	A100241
SDS	Sangon	A100227
Alexa Flour 647-conjugated streptavidin	invitrogen	S21374	1 to 1000
Triethanolamine	Sigma	V900257
Dynabeads M-280 Streptavidin	invitrogen	60210
ammonium bicarbonate	Sigma	9830
Coomassie Brilliant Blue R-250	Thermo Scientific	20278
Isoflurane	RWD Life Science Co.	970-00026-00
DNase I	Sigma	DN25	12 µg/mL
urea	Sigma	U5378