Identification des marqueurs de surface cellulaire des cellules neurales primaires de tige et de progéniture par l'étiquetage métabolique du sialoglycan

Résumé

Présenté ici est un protocole qui combine un système de co-culture neural-endothelial in vitro et l'incorporation métabolique du sialoglycan avec des groupes fonctionnels bioorthogonals pour étendre les cellules neurales primaires de tige et d'ancêtre et étiqueter leur surface sialoglycoproteins pour l'imagerie ou l'analyse de la spectrométrie de masse des marqueurs de surface cellulaire.

Résumé

Les cellules de tige et d'ancêtre neural (NSPc) sont la base cellulaire pour les structures et les fonctions complexes du cerveau. Ils sont situés dans des niches spécialisées in vivo et peuvent être isolés et étendus in vitro,servant de ressource importante pour la transplantation cellulaire pour réparer les lésions cérébrales. Cependant, les NSPC sont hétérogènes et ne sont pas clairement définis au niveau moléculaire ou purifiés en raison d'un manque de marqueurs de surface cellulaire spécifiques. Le protocole présenté, qui a été précédemment rapporté, combine un système de co-culture neural-endothelial avec une méthode métabolique d'étiquetage de glycan pour identifier le sialoglycoproteome de surface des NSPc primaires. Le système de co-culture endothéliale du NSPC permet l'auto-renouvellement et l'expansion des CNS PNS primaires in vitro,générant un nombre suffisant de NSPC. Les Sialoglycanes dans les NSPC cultivés sont étiquetés à l'aide d'un journaliste métabolique de l'acide sialique contre nature avec groupes fonctionnels bioorthogonal. En comparant le sialoglycoproteome des NSPC auto-renouvellements élargis dans une co-culture endothéliale avec la culture neuronale différenciante, nous identifions une liste de protéines membranaires qui sont enrichies dans les NSPC. Dans le détail, le protocole comprend : 1) la mise en place d'une co-culture endothéliale du NSPC et d'une culture différenciante du CNPC; 2) étiquetage avec azidosugar per-O-acetylated N-azidoacetylmannosamine (Ac₄ManNAz); et 3) conjugaison de biotine au sialoglycan modifié pour la formation image après fixation de la culture neurale ou de l'extraction de protéine de la culture neurale pour l'analyse de spectrométrie de masse. Ensuite, les candidats marqueurs de surface enrichis par le NSPC sont sélectionnés par analyse comparative des données de spectrométrie de masse provenant à la fois du NSPC élargi et des cultures neuronales différenciées. Ce protocole est très sensible pour identifier les protéines membranaires de faible abondance dans les matériaux de départ, et il peut être appliqué à la découverte de marqueurs dans d'autres systèmes avec des modifications appropriées

Introduction

Les cellules souches neurales sont définies comme une population de cellules multipotentes qui peut se renouveler pour maintenir une piscine de cellules souches et se différencier en neurones et en gliales. Ils sont les principaux types de cellules dans le système nerveux et peuvent offrir un grand potentiel thérapeutique en médecine régénérative par la transplantation cellulaire dans les cerveaux malades et blessés^1,2. Au fur et à mesure que le développement se poursuit, la population de cellules souches neurales devient hétérogène^3,4, et la proportio....

Protocole

Tous les protocoles animaux utilisés dans cette étude ont été approuvés par l'IACUC (Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux) de l'Université de Tsinghua et exécutés conformément aux lignes directrices de l'IACUC. L'établissement d'animaux de laboratoire de l'Université de Tsinghua a été accrédité par l'AAALAC (Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International). Pour la mise en scène des embryons, la mi-journée du bouchon vaginal identifié a été calculée comme jour embryonnaire 0.5 (E0.5).

REMARQUE: Toutes les cellules sont cultivées dans l'incubateur cellulaire dans de....

Résultats

L'ensemble de la procédure d'expansion in vitro et d'étiquetage métabolique des NSPC embryonnaires primaires prend 6 jours (figure 1A). La qualité de la lignée cellulaire BEND3 et des NSPC primaires fraîchement isolés est la clé d'une expérience réussie. Les cellules BEND3 sont la source de facteurs solubles qui stimulent l'auto-renouvellement et la prolifération des NSPC. Il faut s'assurer que les cellules BEND3 sont exemptes de toute contamination et se div.......

Discussion

Les marqueurs de surface sont couramment utilisés pour étiqueter et purifier des types de cellules spécifiques in vitro et in vivo^17,18. La découverte de marqueurs de surface contribue grandement aux recherches sur la médecine régénérative et les cellules souches en fournissant des outils moléculaires pour enrichir sélectivement une population de cellules souches à partir de tissus normaux ou pathologiques et de plats de culture, offrant une cellule purifiée. pou.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
BEND3	ATCC	CRL-229
DMEM	Gibco	11960044
L-glutamine	Gibco	25030081	1
Pyruvate de sodium	Sigma	P5280	1 %
N2 supplément	Gibco	17502048	1 à 100
N-acétyl-L-cystéine	Sigma	A7250	1 mM
Papain	Worthington	LS003726	10 U/mL
Supplément de B27	Gibco	17504044	1 à 50
Poly-L-lysine	Sigma	P4707
Facteur de croissance des fibroblastes de base	Gibco	PHG0261	10 ng/mL
Pénicilline-Streptomycine	Gibco	15140122	1 %
Sérum fœtal de veau	Gibco	10099141	10 %
HBSS	Gibco	14175095
Tripsin-EDTA, 0,25 %	Gibco	25200056
DPBS	Gibco	14190094
Transwell	Corning	3450
Paraformaldéhyde	Sigma	158127	4 %
Saccharose	Sangon	A100335
DAPI	Gibco	62248
Tampon RIPA	Thermo Scientific	89900
Tampon de chargement SDS-PAGE 2x	Solarbio	P1018
Plaque 6 puits	Corning	3335
Tris-Glycine protein gel	invitrogen	xp00100box
Souris monoclonal anti-Nestin	Étude de développement Hybridoma Bank	Rat-401	1 à 20
Souris monoclonale anti-bêta-tubuline III	Sigma	T8860	1 à 1 000
Alexa Fluor 488 chèvre anti-souris IgG1	invitrogen	A-21121	1 à 1 000
Alexa Fluor 546 chèvre anti-souris IgG2b	invitrogen	A-21143	1 à 1 000
Albumine bovine V	Amresco	0332
Triton X-100	Amresco	0694
BCA kit de dosage	Thermo Scientific	23225
Dimethyl sulfoxyde	Sigma	D2650
Brij97	Aladdin	B129088
CuSO4	Sigma	209198
Alcyne-biotine	Click Chemistry Tools	TA105
BTTAA	Click Chemistry Tools	1236
Ac4ManNAz	Click Outils de Chimie	1084	100 & micro ; M
9AzSia	synthétisé en laboratoire
Ascorbate de sodium	Sigma	A4034
Méthanol	Sigma	34860
EDTA	Sangon	A100322
NaCl	Sangon	A100241
SDS	Sangon	A100227
Alexa Flour 647-conjugué streptavidine	invitrogen	S21374	1 à 1 000
Triéthanolamine	Sigma	V900257
Dynabeads M-280 Streptavidin  ;	invitrogen	60210
Bicarbonate d’ammonium	Sigma	9830
Coomassie Brilliant Blue R-250	Thermo Scientific	20278
Isoflurane	RWD Life Science Co.	970-00026-00
DNase I	Sigma	DN25	12 & micro ; g/mL
Urea	Sigma	U5378

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