Identifizieren von Zelloberflächenmarkern von primären neuralen Stamm- und Vorläuferzellen durch metabolische Kennzeichnung von Sialoglycan

Summary

Präsentiert wird hier ein Protokoll, das ein in vitro neural-endotheliales Kokultursystem und die metabolische Einbeziehung von Sialoglycan mit bioorthogonalen funktionellen Gruppen kombiniert, um primäre neuronale Stamm- und Vorläuferzellen zu erweitern und ihre Oberfläche zu beschriften. sialoglycoproteinzur Bildgebung oder Massenspektrometrieanalyse von Zelloberflächenmarkern.

Abstract

Neurale Stamm- und Vorläuferzellen (NSPCs) sind die zelluläre Basis für die komplexen Strukturen und Funktionen des Gehirns. Sie befinden sich in spezialisierten Nischen in vivo und können isoliert und in vitroerweitert werden und dienen als wichtige Ressource für die Zelltransplantation, um Hirnschäden zu reparieren. NSPC sind jedoch heterogen und auf molekularer Ebene nicht klar definiert oder werden aufgrund des Fehlens spezifischer Zelloberflächenmarker gereinigt. Das vorgestellte Protokoll, das bereits berichtet wurde, kombiniert ein neuronal-endotheliales Kokultursystem mit einer metabolischen Glykan-Etikettierungsmethode, um das Oberflächen-Sialoglycoproteom der primären NSSPCs zu identifizieren. Das NSPC-endotheliale Kokultursystem ermöglicht die Selbsterneuerung und -erweiterung von primären NSPCs in vitround erzeugt eine ausreichende Anzahl von NSPCs. Sialoglycans in kultivierten NSPCs werden mit einem unnatürlichen Sialsäure-Metabolur-Reporter mit bioorthogonale funktionelle Gruppen. Durch den Vergleich der sialoglycoproteome aus sich selbst erneuernden NSPCs, die in einer endotheliaalen Kokultur erweitert wurden, mit der Differenzierung der neuronalen Kultur identifizieren wir eine Liste von Membranproteinen, die in NSPCs angereichert sind. Im Einzelnen umfasst das Protokoll: 1) Einrichtung einer NSPC-endotheliale Kokultur und NSPC-Differenzierungskultur; 2) Etikettierung mit Azidozucker pro-O-acetyliertem N-Azidoacetylmannosamin (Ac₄ManNAz); und 3) Biotinkonjugation zu modifiziertem Sialoglycan zur Bildgebung nach Fixierung der neuronalen Kultur oder Proteinextraktion aus der neuronalen Kultur zur Massenspektrometrieanalyse. Anschließend werden die NSPC-angereicherten Oberflächenmarker-Kandidaten durch vergleichende Analyse von Massenspektrometriedaten sowohl aus dem erweiterten NSPC als auch aus differenzierten neuronalen Kulturen ausgewählt. Dieses Protokoll ist hochsensibel für die Identifizierung von Membranproteinen mit geringem Überfluss in den Ausgangsmaterialien und kann auf die Marker-Erkennung in anderen Systemen mit entsprechenden Modifikationen angewendet werden.

Introduction

Neuronale Stammzellen sind definiert als eine multipotente Zellpopulation, die sich selbst erneuern kann, um einen Stammzellpool zu erhalten und sich in Neuronen und Glia zu differenzieren. Sie sind die wichtigsten Zelltypen im Nervensystem und können großes therapeutisches Potenzial in der regenerativen Medizin durch Zelltransplantation in kranke und verletzte Gehirne^{bieten 1,2}. Mit der Entwicklung wird die neuronale Stammzellpopulation heterogen^3,4, und der Anteil der neuronalen Stammzellen im Gehirn nimmt allmählich ab⁵. Im Allgemeinen befinden sich embryonale neuronale Stammzellen und andere neuronale Vorläuferzellen, kollektiv als neuronale Stamm- und Vorläuferzellen (NSPCs) bezeichnet, in den Keimzonen, der ventrikulären Zone und der subventrikulären Zone in Mäusen⁶. Im embryonalen Gehirn erzeugen neuronale Stammzellen Neuronen direkt oder indirekt über zwischengeschaltete Vorläuferzellen (IPCs) und bei einigen Arten durch die äußeren subventrikulären Zonenvorläufer (oRGs)^7,8. Die spezifische molekulare Signatur, Morphologie, Lage in der Stammzellnische und Differenzierungspotenzial bestimmen die Rolle jedes Subtyps bei der Hirnorganogenese und klinischen Anwendungen⁹. Die derzeit verfügbaren Zelloberflächenmarker können jedoch verschiedene Subtypen von NSPCs nicht eindeutig unterscheiden und reinigen, was das Verständnis und die Nutzung dieser Subtypen einschränkt.

Die Identifizierung der primären NSPCs-Oberflächenmarker wird durch drei Haupthürden begrenzt. Die erste ist die begrenzte Zellanzahl von NSPCs im Gewebe, was es schwierig macht, Zelloberflächenproteinproben für eine gemeinsame Massenspektrometrieanalyse vorzubereiten. Die zweite Einschränkung ist die Schwierigkeit bei der Herstellung reiner Zellsubtypen zur Erzeugung subtypspezifischer Membranproteindaten. Die dritte Herausforderung schließlich ist das niedrige Verhältnis von Zelloberflächenproteinen in ganzen Zellproteinen, das ihre Nachweisempfindlichkeiten durch Massenspektrometrieanalyse behindert.

Um diese Probleme zu überwinden, entwickelten wir einen chemoprotemischen Ansatz zur selektiven Anreicherung und Identifizierung von Zelloberflächenproteinen in primären NSPCs durch metabolische Kennzeichnung der Sialoglycoproteine¹⁰. Um eine ausreichende Anzahl von NSPCs zu generieren, nutzten wir ein etabliertes Protokoll, um primäre embryonale NSPS in undifferenzierten Zuständen in vitro zu erweitern und zu erhalten, indem wir NSPCs mit Maushirn-Endothelzelllinien mit einer durchlässigen Unterstützung kokultieren. Matrixeinsatz(z.B. Transwell) System¹¹. Im Gegensatz dazu erzeugen NPSCs, die allein ohne Endothelzellen kultiviert werden, eine differenzierte Nachkommenschaft^11,12. So können Proteinproben aus diesen beiden Kultursystemen vergleichsweise analysiert werden, um Proteine zu identifizieren, die differenziell in NSPCs und differenzierten Neuronen exprimiert werden. Da die meisten Zelloberflächenproteine durch Sialinsäure¹³modifiziert werden, wurde der unnatürliche Sialinsäurevorläufer analog N-Azidoacetylmannosamin-Tetraacylatd (Ac₄ManNAz) verwendet, um den intrinsischen Stoffwechselweg zu kapern, so dass endogene, neu synthetisierte Sialoglykane werden mit Azido-Gruppen beschriftet, wodurch ein chemischer Griff¹⁴erzeugt wird. Durch azido-alkyne-vermittelte bioorthogonale Reaktionen, die Biotin zu Sialoglycans konjugieren, können Zelloberflächenproteine visualisiert und zur proteomischen Identifizierung durch ein Streptavidin-gekoppeltes Fluorophor oder Matrix¹⁴angereichert werden.

Hier führen wir die Färbung der SDS-PAGE-Gelanalyse der Oberfläche sialoglycoproteome von NSPCs durch, die in einer endotheliaalen Kokultur erweitert sind und Zellen in einem Nicht-Kokultursystem differenzieren. Wir reinigen auch selektiv Oberflächensialoglycoproteome in den beiden Kultursystemen für den proteomischen Vergleich. Unser Protokoll, verglichen mit den traditionellen zentrifugationsbasierten Zelloberflächenreinigungsprotokollen¹⁵, erhöht die Extraktionswirksamkeit durch Reduzierung der Oberflächenproteinextraktionsverfahren durch spezifische Tag-Konjugation und Affinität reinigung. In der Zwischenzeit erhöht es die Extraktionsreinheit von Zelloberflächenproteinen auf der Grundlage der Prämisse, dass Sialylierung vor allem an den Zelloberflächenproteinen stattfindet. Obwohl endotheliale Faktoren die Differenzierung erweiterter NSPC nicht vollständig blockieren können, bietet die vergleichende Studie zwischen einer Kokultur und einer differenzierten Kultur eine bequeme Methode, um mit Stammzellen angereicherte Oberflächenproteine zu lokalisieren, ohne dass Proteine aus NPCs zu analysieren, die durch FACS¹⁶gereinigt werden. Wir glauben, dass dieser Ansatz auf Studien von Oberflächenproteinen in anderen Systemen mit den entsprechenden Modifikationen angewendet werden kann.

Protocol

Alle in dieser Studie verwendeten Tierprotokolle wurden vom IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee) der Tsinghua University genehmigt und in Übereinstimmung mit den Richtlinien des IACUC durchgeführt. Die Labortieranlage der Tsinghua University wurde von der AAALAC (Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International) akkreditiert. Für die Inszenierung von Embryonen wurde der am Mittag des identifizierten Vaginalsteckers als Embryonaltag 0,5 (E0.5) berechnet. <p class="…

Representative Results

Das gesamte Verfahren zur In-vitro-Expansion und metabolischen Kennzeichnung primärer embryonaler NSPCs dauert 6 Tage (Abbildung 1A). Die Qualität der BEND3-Zelllinie und frisch isolierte primäre NSSSPCs sind der Schlüssel zu einem erfolgreichen Experiment. BEND3-Zellen sind die Quelle von löslichen Faktoren, die die Selbsterneuerung und Proliferation von NSPCs stimulieren. Es sollte sichergestellt werden, dass die BEND3-Zellen frei von Kontamination sin…

Discussion

Oberflächenmarker werden häufig verwendet, um bestimmte Zelltypen in vitro und in vivo^17,18zu beschriften und zu reinigen. Die Entdeckung von Oberflächenmarkern trägt wesentlich zur regenerativen Medizin und Stammzellforschung bei, indem molekulare Werkzeuge zur selektiven Anreicherung einer Stammzellpopulation aus normalen oder pathologischen Geweben und Kulturgerichten zur Verfügung gestellt werden, die eine gereinigte Zelle anbieten. Ressourcen für die k…

Materials

BEND3	ATCC	CRL-229
DMEM	Gibco	11960044
L-glutamine	Gibco	25030081	1%
Sodium pyruvate	Sigma	P5280	1%
N2 supplement	Gibco	17502048	1 to 100
N-acetyl-L-cysteine	Sigma	A7250	1 mM
Papain	Worthington	LS003726	10 U/mL
B27 supplement	Gibco	17504044	1 to 50
Poly-L-lysine	Sigma	P4707
basic Fibroblast growth factor	Gibco	PHG0261	10 ng/mL
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	1%
Fetal bovine serum	Gibco	10099141	10%
HBSS	Gibco	14175095
Tripsin-EDTA, 0.25%	Gibco	25200056
DPBS	Gibco	14190094
Transwell	Corning	3450
Paraformaldehyde	Sigma	158127	4%
Sucrose	Sangon	A100335
DAPI	Gibco	62248
RIPA buffer	Thermo Scientific	89900
SDS-PAGE loading buffer 2X	Solarbio	P1018
6-well plate	Corning	3335
Tris-Glycine protein gel	invitrogen	xp00100box
mouse monoclonal anti-Nestin	Developmental Study Hybridoma Bank	Rat-401	1 to 20
mouse monoclonal anti-beta-tubulin III	Sigma	T8860	1 to 1000
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1	invitrogen	A-21121	1 to 1000
Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG2b	invitrogen	A-21143	1 to 1000
Albumin Bovine V	Amresco	0332
Triton X-100	Amresco	0694
BCA assay kit	Thermo Scientific	23225
dimethyl sulfoxide	Sigma	D2650
Brij97	Aladdin	B129088
CuSO4	Sigma	209198
alkyne-biotin	Click Chemistry Tools	TA105
BTTAA	Click Chemistry Tools	1236
Ac4ManNAz	Click Chemistry Tools	1084	100 µM
9AzSia	synthesized in lab
sodium ascorbate	Sigma	A4034
Methanol	Sigma	34860
EDTA	Sangon	A100322
NaCl	Sangon	A100241
SDS	Sangon	A100227
Alexa Flour 647-conjugated streptavidin	invitrogen	S21374	1 to 1000
Triethanolamine	Sigma	V900257
Dynabeads M-280 Streptavidin	invitrogen	60210
ammonium bicarbonate	Sigma	9830
Coomassie Brilliant Blue R-250	Thermo Scientific	20278
Isoflurane	RWD Life Science Co.	970-00026-00
DNase I	Sigma	DN25	12 µg/mL
urea	Sigma	U5378