تحديد علامات سطح الخلية من الجذعية العصبية الأولية والخلايا السلف عن طريق وضع العلامات الأيضية من Sialoglycan
Summary
يقدم هنا هو البروتوكول الذي يجمع بين في المختبر العصبية بطانة نظام الثقافة المشتركة والدمج الأيضي للسيالوجيكان مع المجموعات الوظيفية bioorthogonal لتوسيع الجذعية العصبية الأولية والخلايا السلف وتسمية سطحها البروتينات السيالوجية للتصوير أو تحليل الطيف الكتلي لعلامات سطح الخلية.
Abstract
الجذعية العصبية والخلايا السلف (NSPCs) هي الأساس الخلوي للهياكل المعقدة ووظائف الدماغ. وهي تقع في محاريب متخصصة في الجسم الحي ويمكن عزلها وتوسيعها في المختبر، بمثابة مورد مهم لزراعة الخلايا لإصلاح تلف الدماغ. ومع ذلك، فإن الـ NSPCs غير متجانسة وغير محددة بوضوح على المستوى الجزيئي أو يتم تنقيتها بسبب عدم وجود علامات سطح الخلية المحددة. البروتوكول المقدم، الذي تم الإبلاغ عنه سابقاً، يجمع بين نظام الثقافة المشتركة العصبية البطانة مع طريقة وضع العلامات على الغليكان الأيضي لتحديد سطح sialoglycoproteome من NSPCs الأولية. يسمح نظام الثقافة المشتركة NSPC-endothelial بالتجديد الذاتي وتوسيع المراكز الوطنية للدعم والتغذية الأولية في المختبر،مما يولد عدداً كافياً من الـ NSPCs. المجموعات الوظيفية البيوثوغنالية. من خلال مقارنة sialoglycoproteome من NSPCs التجديد الذاتي توسعت في ثقافة مشتركة بطانة مع الثقافة العصبية المختلفة، ونحن تحديد قائمة من البروتينات الغشاء التي يتم إثراء في NSPCs. وينطوي البروتوكول بالتفصيل على ما يلي: (1) إنشاء ثقافة مشتركة بين البطانة والبطانة الوطنية وثقافة مختلفة؛ (2) إنشاء ثقافة مشتركة بين البطانة والبطانة الوطنية؛ (2) إنشاء ثقافة مشتركة بين البطانة والبطانة الوطنية؛ (3) إنشاء ثقافة مشتركة بين البطانة والبطانة الوطنية؛ (3) إنشاء ثقافة مشتركة بين البطانة والبطانة الوطنية؛ (3) إنشاء ثقافة مشتركة بين البطان 2) وضع العلامات مع azidosugar لكل O-أسيتيل N-azidoacetylmannosamine (Ac4ManNAz)؛ و 3) البيوتين الاقتران إلى sialoglycan المعدلة للتصوير بعد تثبيت الثقافة العصبية أو استخراج البروتين من الثقافة العصبية لتحليل الطيف الكتلي. ثم يتم اختيار المرشحين علامة سطح المخصب NSPC عن طريق التحليل المقارن لبيانات قياس الطيف الكتلي من كل من NSPC الموسعة والثقافات العصبية المتمايزة. هذا البروتوكول حساس للغاية لتحديد بروتينات الغشاء ذات الوفرة المنخفضة في مواد البداية، ويمكن تطبيقه على اكتشاف العلامات في أنظمة أخرى مع التعديلات المناسبة
Introduction
يتم تعريف الخلايا الجذعية العصبية على أنها مجموعة خلايا متعددة القوى التي يمكن تجديدها ذاتيا للحفاظ على تجمع الخلايا الجذعية والتفريق في الخلايا العصبية وغليا. وهي أنواع الخلايا الرئيسية في الجهاز العصبي ويمكن أن توفر إمكانات علاجية كبيرة في الطب التجديدي من خلال زرع الخلايا في العقول المريضة والمصابة1،2. مع تقدم التنمية ، يصبح عدد الخلايا الجذعية العصبية غيرمتجانسة 3،4، وتنخفض نسبة الخلايا الجذعية العصبية في الدماغ تدريجيا5. بشكل عام، توجد الخلايا الجذعية العصبية الجنينية وغيرها من الخلايا السلف العصبية، وتسمى مجتمعة الجذعية العصبية والخلايا السلف (NSPCs)، في المناطق الإنباتية، والمنطقة البطينية، والمنطقة التحتية في الفئران6. في الدماغ الجنيني، تولد الخلايا الجذعية العصبية الخلايا العصبية بشكل مباشر أو غير مباشر من خلال خلايا السلف المتوسطة (IPCs)، وفي بعض الأنواع من خلال الذرية المنطقة الفرعية الخارجية (oRGs)7،8. التوقيع الجزيئي المحدد، مورفولوجيا، الموقع في محراب الخلايا الجذعية، وإمكانات التمايز كلها تحدد دور كل نوع فرعي في تكوين الأعضاء في الدماغ والتطبيقات السريرية9. ومع ذلك، فإن علامات سطح الخلية المتاحة حاليالا يمكن أن تميز بشكل لا لبس فيه وتنقية أنواع فرعية مختلفة من NSPCs، مما يحد من فهم واستخدام هذه الأنواع الفرعية.
ويحد من تحديد العلامات السطحية الأولية للمراكز الوطنية للدعم في مجال الحماية ثلاث عقبات رئيسية. الأول هو عدد الخلايا المحدودة من NSPCs في الأنسجة، مما يجعل من الصعب إعداد عينات بروتين سطح الخلية لتحليل قياس الطيف الكتلي المشترك. والقيد الثاني هو صعوبة إنتاج أنواع فرعية من الخلايا النقية لتوليد بيانات بروتين الغشاء الخاص بالنوع الفرعي. وأخيرا، فإن التحدي الثالث هو انخفاض نسبة البروتينات السطحية للخلايا في بروتينات الخلايا بأكملها، مما يعوق حساسياتها الكشف عن طريق تحليل قياس الطيف الكتلي.
للتغلب على هذه المشاكل، قمنا بتطوير نهج كيميائي لتخصيب وتحديد البروتينات السطحية للخلايا بشكل انتقائي في NSPCs الأولية عن طريق وضع العلامات الأيضية للبروتينات sialoglycoproteins10. لتوليد عدد كاف من النقاط الاستراتيجية الوطنية، استفدنا من بروتوكول راسخ لتوسيع والحفاظ على الـ NSPCs الجنينية الأولية في الدول غير المتمايزة في المختبر، من خلال المشاركة في زراعة NSPCs مع خطوط الخلايا البطانية الدماغ الماوس باستخدام دعم نفاذية مصفوفة إدراج(على سبيل المثال، transwell) نظام11. وعلى النقيض من ذلك، فإن NPSCs المستزرعة وحدها دون الخلايا البطانية تولد ذرية مختلفة11،12. وهكذا، يمكن تحليل عينات البروتين من هذين النظامين الثقافة نسبيا لتحديد البروتينات التي يتم التعبير عنها بشكل تفاضلي في NSPCs والخلايا العصبية المتمايزة. كما يتم تعديل معظم البروتينات السطحية الخلية من قبل حمض السياليك13، غير طبيعي حمض السياليك السلائف التناظرية N-azidoacetylmannosamine-tetraacylated (Ac4ManNAz) تم استخدامها لاختطاف المسار الأيضي المتأصلة بحيث الذاتية ، حديثا يتم تسمية sialoglycans توليفها مع مجموعات azido، وتوليد مقبض كيميائي14. من خلال التفاعلات الحيوية الأزيدو-الألكيين بوساطة، والتي تترافق الكائنات الحية إلى السيالوجيكانات، يمكن تصور البروتينات السطحية للخلايا وإثرائها لتحديد البروتيوميك من خلال فلوروفور أو مصفوفة14.
هنا، نقوم بتلطيخ تحليل هلام SDS-PAGE للسطح sialoglycoproteome من NSPCs الموسعة في ثقافة مشتركة بطانة وخلايا مختلفة في نظام غير ثقافة مشتركة. نحن أيضا تنقية انتقائية سطح sialoglycoproteome في نظامين الثقافة للمقارنة البروتيومية. بروتوكولنا، مقارنة مع التقليدية المستندة إلى الطرد المركزي خلية سطح البروتوكولاتتنقية 15،يزيد من فعالية استخراج عن طريق الحد من إجراءات استخراج البروتين السطحي من خلال اقتران علامة محددة وتقارب تنقيه. وفي الوقت نفسه، فإنه يزيد من نقاء استخراج البروتينات سطح الخلية على أساس فرضية أن sialylation يحدث في الغالب في البروتينات سطح الخلية. على الرغم من أن العوامل البطانية لا يمكن أن تمنع تماما التفريق بين NSPCs الموسعة، فإن الدراسة المقارنة بين الثقافة المشتركة والثقافة المتمايزة توفر طريقة ملائمة لتحديد البروتينات السطحية الغنية بالخلايا الجذعية دون الحاجة إلى تحليل البروتينات من NPCs تنقية من قبل FACS16. ونحن نعتقد أن هذا النهج يمكن تطبيقه على دراسات البروتينات السطحية في أنظمة أخرى مع التعديلات المناسبة.
Protocol
Representative Results
Discussion
وتستخدم عادة علامات السطح لتسمية وتنقية أنواع محددة من الخلايا في المختبر وفي الجسم الحي17،18. اكتشاف علامات السطح يساهم إلى حد كبير في الطب التجديدي وأبحاث الخلايا الجذعية من خلال توفير الأدوات الجزيئية لإثراء انتقائي لسكان الخلايا الجذعية من الأنسجة العا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الشكل 1 باء و 1 جيم و 1 هاء و 1 واو مستنسخة من باي وآخرون . 10 سنوات بإذن من الجمعية الملكية للكيمياء. نشكر يي هاو في مختبر X.C. لتحرير الرقم. ويدعم هذا العمل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 91753206 إلى Q. S. وX.C., No. 31371093 to Q.S., and Nos. 21425204 and 21672013 to X. C.).
Materials
| BEND3 | ATCC | CRL-229 | |
| DMEM | Gibco | 11960044 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030081 | 1% |
| Sodium pyruvate | Sigma | P5280 | 1% |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | 1 to 100 |
| N-acetyl-L-cysteine | Sigma | A7250 | 1 mM |
| Papain | Worthington | LS003726 | 10 U/mL |
| B27 supplement | Gibco | 17504044 | 1 to 50 |
| Poly-L-lysine | Sigma | P4707 | |
| basic Fibroblast growth factor | Gibco | PHG0261 | 10 ng/mL |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | 1% |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10099141 | 10% |
| HBSS | Gibco | 14175095 | |
| Tripsin-EDTA, 0.25% | Gibco | 25200056 | |
| DPBS | Gibco | 14190094 | |
| Transwell | Corning | 3450 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | 4% |
| Sucrose | Sangon | A100335 | |
| DAPI | Gibco | 62248 | |
| RIPA buffer | Thermo Scientific | 89900 | |
| SDS-PAGE loading buffer 2X | Solarbio | P1018 | |
| 6-well plate | Corning | 3335 | |
| Tris-Glycine protein gel | invitrogen | xp00100box | |
| mouse monoclonal anti-Nestin | Developmental Study Hybridoma Bank | Rat-401 | 1 to 20 |
| mouse monoclonal anti-beta-tubulin III | Sigma | T8860 | 1 to 1000 |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1 | invitrogen | A-21121 | 1 to 1000 |
| Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG2b | invitrogen | A-21143 | 1 to 1000 |
| Albumin Bovine V | Amresco | 0332 | |
| Triton X-100 | Amresco | 0694 | |
| BCA assay kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Brij97 | Aladdin | B129088 | |
| CuSO4 | Sigma | 209198 | |
| alkyne-biotin | Click Chemistry Tools | TA105 | |
| BTTAA | Click Chemistry Tools | 1236 | |
| Ac4ManNAz | Click Chemistry Tools | 1084 | 100 µM |
| 9AzSia | synthesized in lab | ||
| sodium ascorbate | Sigma | A4034 | |
| Methanol | Sigma | 34860 | |
| EDTA | Sangon | A100322 | |
| NaCl | Sangon | A100241 | |
| SDS | Sangon | A100227 | |
| Alexa Flour 647-conjugated streptavidin | invitrogen | S21374 | 1 to 1000 |
| Triethanolamine | Sigma | V900257 | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | invitrogen | 60210 | |
| ammonium bicarbonate | Sigma | 9830 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Thermo Scientific | 20278 | |
| Isoflurane | RWD Life Science Co. | 970-00026-00 | |
| DNase I | Sigma | DN25 | 12 µg/mL |
| urea | Sigma | U5378 |
References
- Weissman, I. L. Stem Cells: Units of Development, Units of Regeneration, and Units in Evolution. Cell. 100, 157-168 (2000).
- Gage, F. H., Temple, S. Neural Stem Cells: Generating and Regenerating the Brain. Neuron. 80, 588-601 (2013).
- Gal, J. S. Molecular and Morphological Heterogeneity of Neural Precursors in the Mouse Neocortical Proliferative Zones. Journal of Neuroscience. 26, 1045-1056 (2006).
- Kawaguchi, A., et al. Single-cell gene profiling defines differential progenitor subclasses in mammalian neurogenesis. Development. 135, 3113-3124 (2008).
- Temple, S. The development of neural stem cells. Nature. 414, 112-117 (2001).
- Kwan, K. Y., Sestan, N., Anton, E. S. Transcriptional co-regulation of neuronal migration and laminar identity in the neocortex. Development. 139, 1535-1546 (2012).
- Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The Glial Nature of Embryonic and Adult Neural Stem Cells. Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).
- Wang, X., Tsai, J. W., LaMonica, B., Kriegstein, A. R. A new subtype of progenitor cell in the mouse embryonic neocortex. Nature Neuroscience. 14, 555-561 (2011).
- Taverna, E., Götz, M., Huttner, W. B. The Cell Biology of Neurogenesis: Toward an Understanding of the Development and Evolution of the Neocortex. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 465-502 (2014).
- Bai, Q. R., Dong, L., Hao, Y., Chen, X., Shen, Q. Metabolic glycan labeling-assisted discovery of cell-surface markers for primary neural stem and progenitor cells. Chemical Communications. 54, 5486-5489 (2018).
- Shen, Q., et al. Endothelial cells stimulate self-renewal and expand neurogenesis of neural stem cells. Science. 304, 1338-1340 (2004).
- Qian, X., et al. Timing of CNS cell generation: a programmed sequence of neuron and glial cell production from isolated murine cortical stem cells. Neuron. 28, 69-80 (2000).
- Varki, A. Glycan-based interactions involving vertebrate sialic-acid-recognizing proteins. Nature. 446, 1023-1029 (2007).
- Cheng, B., Xie, R., Dong, L., Chen, X. Metabolic Remodeling of Cell-Surface Sialic Acids: Principles, Applications, and Recent Advances. ChemBioChem. 17, 11-27 (2016).
- Lin, S. H., Guidotti, G. Purification of Membrane Proteins. Methods in Enzymology. 463, 619-629 (2009).
- Schmidt, J. R., et al. Pilot Study on Mass Spectrometry-Based Analysis of the Proteome of CD34+CD123+ Progenitor Cells for the Identification of Potential Targets for Immunotherapy in Acute Myeloid Leukemia. Proteomes. 6, (2018).
- Crisan, M., Dzierzak, E. The many faces of hematopoietic stem cell heterogeneity Development. Development. 144, 4195-4195 (2017).
- Uchida, N., et al. Direct isolation of human central nervous system stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 14720-14725 (2000).
- Qin, W., et al. Artificial Cysteine S-Glycosylation Induced by Per-O-Acetylated Unnatural Monosaccharides during Metabolic Glycan Labeling. Angewandte Chemie International Edition. , (2018).
- Gry, M., et al. Correlations between RNA and protein expression profiles in 23 human cell lines. BMC Genomics. 10, 365 (2009).
- Hennen, E., et al. A LewisX Glycoprotein Screen Identifies the Low Density Lipoprotein Receptor-related Protein 1 (LRP1) as a Modulator of Oligodendrogenesis in Mice. Journal of Biological Chemistry. 288, 16538-16545 (2013).
- Seet, B. T., Dikic, I., Zhou, M. M., Pawson, T. Reading protein modifications with interaction domains. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7, 473-483 (2006).
- O’Brian, C. A., Chu, F. ReviewPost-translational disulfide modifications in cell signaling—role of inter-protein, intra-protein, S-glutathionyl, and S-cysteaminyl disulfide modifications in signal transmission. Free Radical Research. 39, 471-480 (2005).
- Williamson, A. J. K., Whetton, A. D. The requirement for proteomics to unravel stem cell regulatory mechanisms. Journal of Cellular Physiology. 226, 2478-2483 (2011).
- Christensen, B., et al. Cell Type-specific Post-translational Modifications of Mouse Osteopontin Are Associated with Different Adhesive Properties. Journal of Biological Chemistry. 282, 19463-19472 (2007).
- Yanagisawa, M., Yu, R. K. The expression and functions of glycoconjugates in neural stem cells. Glycobiology. 17, 57R-74R (2007).
- Best, M. D. Click Chemistry and Bioorthogonal Reactions: Unprecedented Selectivity in the Labeling of Biological Molecules. Biochemistry. 48, 6571-6584 (2009).
