Identifiera cell ytan markörer av primära neurala stamceller och stamceller genom metabolisk märkning av Sialoglycan

Summary

Presenteras här är ett protokoll som kombinerar en in vitro -neural-endotelial Co-Culture system och metabolisk inkorporering av sialoglycan med bioorthogonal funktionella grupper för att expandera primära neurala stamceller och stamceller och märka deras yta sialoglykoproteiner för avbildning eller masspektrometri analys av cell ytan markörer.

Abstract

Neurala stamceller och progenitorceller (NSPCs) är den cellulära grunden för komplexa strukturer och funktioner i hjärnan. De är belägna i specialiserade nischer in vivo och kan isoleras och utvidgas in vitro, som fungerar som en viktig resurs för celltransplantation för att reparera hjärnskador. Emellertid, NSPCs är heterogena och inte klart definierade på molekylär nivå eller renas på grund av brist på specifika cell ytan markörer. Det protokoll som presenteras, som tidigare har rapporterats, kombinerar en neural-endotelial Co-Culture system med en metabolisk glykananalys märkningsmetod för att identifiera ytan sialoglykoproteome av primära nspcs. NSPC-endotelial Co-Culture-systemet möjliggör självförnyelse och expansion av primära NSPCs in vitro, vilket genererar ett tillräckligt antal nspcs. Sialoglycans i odlade nspcs är märkta med en onaturlig sialic Acid metabolisk reporter med bioortogonala funktionella grupper. Genom att jämföra sialoglykoproteome från självförnyande NSPCs expanderat i en endotelial Co-kultur med differentierande neural kultur, identifierar vi en lista över membranproteiner som är berikade i NSPCs. Protokollet omfattar i detalj: 1) uppsättning av en NSPC-endotelial samkultur och NSPC-differentierande kultur. 2) märkning med azidosugar per-O-acetylerade N-azidoacetylmannosamin (AC₄mannaz); och 3) biotin konjugation till modifierad sialoglycan för avbildning efter fixering av neurala kulturen eller protein utvinning från neurala kulturen för masspektrometri analys. Sedan, den NSPC-berikad yta markör kandidater väljs genom jämförande analys av masspektrometri data från både den expanderade NSPC och differentierade neurala kulturer. Detta protokoll är mycket känsligt för att identifiera membranproteiner med låg förekomst i utgångsmaterialen, och det kan appliceras på markör identifiering i andra system med lämpliga modifieringar

Introduction

Neurala stamceller definieras som en multipotenta cellpopulation som kan förnyas för att bibehålla en stamcellspool och differentieras till nervceller och glia. De är de stora celltyperna i nervsystemet och kan erbjuda stor terapeutisk potential i regenerativ medicin genom celltransplantation till sjuka och skadade hjärnor^1,2. Som utveckling fortsätter, den neurala stamceller befolkningen blir heterogena^3,4, och andelen av neurala stamceller i hjärnan minskar gradvis⁵. Generellt sett, embryonala neurala stamceller och andra neurala stamceller, kallas kollektivt neurala stamceller och stamceller (NSPCs), finns i de embryon zoner, ventrikulär zon, och subventrikulär zon i möss⁶. I den embryonala hjärnan, neurala stamceller generera nervceller direkt eller indirekt genom mellanliggande stamceller (IPCS), och i vissa arter genom den yttre subventrikulär zon progenitorer (oRGs)^7,8. Den specifika molekylära signatur, morfologi, lokalisering i stamceller nisch, och differentiering potential alla bestämma vilken roll varje subtyp i hjärnans organogenes och kliniska tillämpningar⁹. De tillgängliga cell ytmarkörerna kan dock inte entydigt diskriminera och rena olika undertyper av NSPCs, vilket begränsar förståelsen och utnyttjandet av dessa undertyper.

Identifieringen av primära NSPCs-ytmarkörer begränsas av tre stora hinder. Den första är den begränsade cellantal NSPCs i vävnaden, vilket gör det svårt att förbereda cell ytan protein prover för vanliga masspektrometri analys. Den andra begränsningen är svårigheten att producera rena cell undertyper för att generera subtypspecifika membranprotein data. Slutligen är den tredje utmaningen den låga kvoten av cellytproteiner i hela cellproteiner, vilket hämmar deras detektionskänslighet genom masspektrometrianalys.

För att övervinna dessa problem, utvecklade vi en chemoproteomic metod för att selektivt berika och identifiera cellyta proteiner i primära NSPCs genom metaboliskt märkning av sialoglykoproteiner¹⁰. För att generera ett tillräckligt antal nspcs, drog vi fördel av ett etablerat protokoll för att expandera och underhålla primära embryonala nspcs i odifferentierade tillstånd in vitro, genom Co-culturing nspcs med mus hjärnan endotelcelllinjer med hjälp av en genomsläpplig stöd Matrix INSERT (t. ex. transwell) system¹¹. I motsats, npscs odlade ensam utan endotelceller generera differentierade avkomma^11,12. Sålunda, protein prover från dessa två kultur system kan vara jämförelsevis analyseras för att identifiera proteiner som är differentially uttrycks i NSPCs och differentierade nervceller. Eftersom de flesta cell ytan proteiner modifieras av sialic Acid¹³, onaturliga sialic Acid föregångare analog N-azidoacetylmannosamine-tetraacylated (AC₄mannaz) användes för att kapa den inneboende metaboliska vägen så att endogena, nyligen syntetiserade sialoglycans är märkta med azid grupper, generera ett kemiskt handtag¹⁴. Genom azido-alkyne-medierade biologiska ortogonala reaktioner, som konjugera biotin till sialoglycans, kan cellytproteiner visualiseras och berikas för proteomisk identifiering genom en streptavidin-kopplad fluorophore eller Matrix¹⁴.

Här utför vi färgning av SDS-PAGE gel analys av ytan sialoglykoproteome från NSPCs expanderat i en endotelial samodling och differentiera celler i en icke-Co-kultur system. Vi rengör också selektivt ytan sialoglykoproteome i de två kultur system för proteomisk jämförelse. Vårt protokoll, jämfört med den traditionella centrifugering-baserade cell ytan renings protokoll¹⁵, ökar utvinning effektivitet genom att minska ytan protein utvinning förfaranden genom specifika tagg konjugering och samhörighet Rening. Samtidigt ökar det utvinning renhet cell ytan proteiner bygger på förutsättningen att sialylation sker mestadels på cellytan proteiner. Även om endoteliala faktorer inte helt kan blockera differentiering av expanderade NSPCs, är den jämförande studien mellan en samkultur och differentierad kultur en praktisk metod för att lokalisera stamceller-berikade ytproteiner utan att behöva analysera proteiner från NPCs renade av FACS¹⁶. Vi anser att detta tillvägagångssätt kan tillämpas på studier av ytproteiner i andra system med lämpliga modifieringar.

Protocol

Alla djur protokoll som används i denna studie godkändes av IACUC (institutionella djuromsorg och användning kommittén) av Tsinghua University och utförs i enlighet med riktlinjer för IACUC. Laboratorie djuret anläggningen vid Tsinghua University har ackrediterats av AAALAC (Association för bedömning och ackreditering av laboratoriedjur omsorg International). För iscensättning av embryon, mitt på dagen av vaginalpluggen identifierats beräknades som embryonala dag 0,5 (E 0.5). <str…

Representative Results

Hela förfarandet för in vitro-expansion och metabolisk märkning av primära embryonala NSPCs tar 6 dagar (figur 1a). Kvaliteten på BEND3-celllinjen och nyligen isolerade primära NSPCs är nyckeln till ett lyckat experiment. BEND3 celler är källan till lösliga faktorer som stimulerar självförnyelse och spridning av NSPCs. Det bör säkerställas att de BEND3 cellerna är fria från kontaminering och dela aktivt med minimal celldöd innan Co-odling me…

Discussion

Ytmarkörer används ofta för att märka och rena specifika celltyper in vitro och in vivo^17,18. Upptäckten av ytmarkörer bidrar i hög grad till regenerativ medicin och stamcells forskning genom att tillhandahålla molekylära verktyg för att selektivt berika en stamcells population från normala eller patologiska vävnader och kultur rätter, som erbjuder en renad cell resurs för klinisk användning eller studiet av biologiska egenskaper. Framstegen med at…

Materials

BEND3	ATCC	CRL-229
DMEM	Gibco	11960044
L-glutamine	Gibco	25030081	1%
Sodium pyruvate	Sigma	P5280	1%
N2 supplement	Gibco	17502048	1 to 100
N-acetyl-L-cysteine	Sigma	A7250	1 mM
Papain	Worthington	LS003726	10 U/mL
B27 supplement	Gibco	17504044	1 to 50
Poly-L-lysine	Sigma	P4707
basic Fibroblast growth factor	Gibco	PHG0261	10 ng/mL
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	1%
Fetal bovine serum	Gibco	10099141	10%
HBSS	Gibco	14175095
Tripsin-EDTA, 0.25%	Gibco	25200056
DPBS	Gibco	14190094
Transwell	Corning	3450
Paraformaldehyde	Sigma	158127	4%
Sucrose	Sangon	A100335
DAPI	Gibco	62248
RIPA buffer	Thermo Scientific	89900
SDS-PAGE loading buffer 2X	Solarbio	P1018
6-well plate	Corning	3335
Tris-Glycine protein gel	invitrogen	xp00100box
mouse monoclonal anti-Nestin	Developmental Study Hybridoma Bank	Rat-401	1 to 20
mouse monoclonal anti-beta-tubulin III	Sigma	T8860	1 to 1000
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1	invitrogen	A-21121	1 to 1000
Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG2b	invitrogen	A-21143	1 to 1000
Albumin Bovine V	Amresco	0332
Triton X-100	Amresco	0694
BCA assay kit	Thermo Scientific	23225
dimethyl sulfoxide	Sigma	D2650
Brij97	Aladdin	B129088
CuSO4	Sigma	209198
alkyne-biotin	Click Chemistry Tools	TA105
BTTAA	Click Chemistry Tools	1236
Ac4ManNAz	Click Chemistry Tools	1084	100 µM
9AzSia	synthesized in lab
sodium ascorbate	Sigma	A4034
Methanol	Sigma	34860
EDTA	Sangon	A100322
NaCl	Sangon	A100241
SDS	Sangon	A100227
Alexa Flour 647-conjugated streptavidin	invitrogen	S21374	1 to 1000
Triethanolamine	Sigma	V900257
Dynabeads M-280 Streptavidin	invitrogen	60210
ammonium bicarbonate	Sigma	9830
Coomassie Brilliant Blue R-250	Thermo Scientific	20278
Isoflurane	RWD Life Science Co.	970-00026-00
DNase I	Sigma	DN25	12 µg/mL
urea	Sigma	U5378