Immobilisierung von Live Caenorhabditis Elegans Einzelpersonen, die eine ultraflache Polydimethylsiloxan Mikrofluidik-Chip mit Wassereinlagerungen
Summary
Eine Reihe von Immobilisierung Methoden wurde gegründet, um die gezielte Bestrahlung von live Caenorhabditis Elegans ermöglichen Einzelpersonen mit einer neu entwickelten ultra-dünnen Polydimethylsiloxan mikrofluidischen chip mit Wassereinlagerungen. Dieser Roman auf dem Chip Immobilisierung ist auch ausreichend für imaging-Beobachtungen. Die ausführliche Behandlung und Anwendungsbeispiele des Chips werden erläutert.
Abstract
Strahlung ist weit verbreitet, für Anwendungen in der Biologie und Ionenstrahl-Zucht, und unter diesen Verfahren Microbeam Bestrahlung stellt ein mächtiges Mittel der Identifizierung von strahlenempfindlichen Websites in lebenden Organismen. Dieses Papier beschreibt eine Reihe von auf dem Chip Immobilisierung Methoden zur gezielten Microbeam Bestrahlung von live Individuen von Caenorhabditis Elegansentwickelt. Insbesondere die Behandlung von Polydimethylsiloxan (PDMS) mikrofluidischen Chips, die wir zuvor entwickelt, um C. Elegans Personen ohne die Notwendigkeit zu immobilisieren, für Anästhesie detailliert erklärt wird. Dieser Chip, genannt ein Wurm-Blatt ist anfällig für mikrofluidische Kanäle erweitert werden können und die Elastizität erlaubt Tiere sanft umhüllt werden. Auch können aufgrund der selbständigen Aufnahmekapazität von der PDMS Tiere verschlossen ist in den Kanälen durch Abdecken der Wurm Blechoberfläche mit einer dünnen Abdeckfolie, in denen Tiere nicht in die Kanäle für das Gehäuse gedrückt werden. Durch Drehen des Deckels film über, können wir leicht die Tiere sammeln. Darüber hinaus das Wurm-Blatt zeigt Wassereinlagerungen und ermöglicht C. Elegans Einzelpersonen mikroskopische Beobachtung über einen längeren Zeitraum unter live-Bedingungen ausgesetzt sind. Darüber hinaus ist das Blatt nur 300 µm dick, so dass schwere Ionen wie Kohlenstoff-Ionen passieren das Blatt umschließt die Tiere, so dass die Ionen Teilchen erkannt werden und die angewandte Strahlendosis genau gemessen werden. Denn Auswahl der Abdeckung Filme verwendet zum umschließen die Tiere sehr wichtig für erfolgreiche langfristige Immobilisierung, wir haben die Auswahl der geeigneten Abdeckfolien und zeigte ein empfehlenswertes Hotel bei einigen Filmen. Als Anwendungsbeispiel des Chips haben wir bildgebende Beobachtung der muskuläre Aktivitäten der Tiere umschließt des mikrofluidischen Kanals das Wurm-Blatt sowie die Microbeam Bestrahlung eingeführt. Diese Beispiele zeigen, dass der Wurm Blätter erheblich die Möglichkeiten für biologische Experimente erweitert haben.
Introduction
Strahlung, einschließlich Röntgenstrahlen, Gammastrahlen und Schwerionen-Balken, ist weit verbreitet für biologische Anwendungen wie z. B. Krebsdiagnose und Behandlung und für die Ionenstrahl-Zucht. Zahlreiche Studien und technische Entwicklungen konzentrieren derzeit über die Auswirkungen von Strahlung1,2,3. Microbeam Bestrahlung ist ein mächtiges Mittel identifizieren strahlenempfindlichen Standorte in lebenden Organismen4. Die Takasaki Advanced Strahlung Institut des nationalen Forschungsinstitute für Quantum und radiologischen Science and Technology (QST-Takasaki) entwickelt eine Technologie, um einzelne Zellen unter mikroskopischer Beobachtung mit Schwerionen-Bestrahlung Microbeams5, und hat Methoden zur gezielten Microbeam Bestrahlung von mehreren Modell Tieren, wie dem Fadenwurm Caenorhabditis Elegans4,6, Seidenraupen7und Oryzias aktivieren Latipes (japanische Medaka)8. Gezielte Microbeam Bestrahlung von Nematoden C. Elegans ermöglicht die effektive Knockdown von bestimmten Regionen, wie den Nerv-Ring im Kopfbereich, damit um die Rollen dieser Systeme in Prozesse wie Fortbewegung zu identifizieren.
Eine Methode für die auf dem Chip Immobilisierung von C. Elegans Personen ohne die Notwendigkeit für die Anästhesie wurde entwickelt, um Microbeam Bestrahlung4zu ermöglichen. Darüber hinaus zur Verbesserung der in der vorherigen Studie4verwendeten mikrofluidischen Chips entwickelten vor kurzem wir benetzbar, Ion-durchlässig, Polydimethylsiloxan (PDMS) mikrofluidischen Chips, bezeichnet als Wurm Blätter (siehe Tabelle der Materialien), für C. Elegans Individuen9Immobilisierung. Diese bestehen aus ultra-dünnen weichen Laken (Dicke = 300 µm; Breite = 15 mm; Länge = 15 mm) mit mehreren (20 oder 25) gerade mikrofluidischen Kanälen (Tiefe 70 µm; = Breite = 60 µm oder 50 µm; Länge = 8 mm) an der Oberfläche (Abb. 1A-D). Mikrofluidische Kanäle sind offen und können mehrere Tiere gleichzeitig in ihnen eingeschlossen werden (Abbildung 1E). Die Blätter sind anfällig für mikrofluidische Kanäle (von ca. 10 %, Abbildung 1F) erweitert werden können und die Elastizität erlaubt Tiere sanft umhüllt werden. Auch können aufgrund der selbständigen Aufnahmekapazität von der PDMS Tiere verschlossen ist in den Kanälen durch Abdecken der Wurm Blechoberfläche mit einer dünnen Abdeckfolie, in denen Tiere nicht in die Kanäle für das Gehäuse gedrückt werden. Durch Drehen des Deckels film über, können wir leicht die Tiere sammeln.
Die Kanäle nicht zu verletzen die Würmer wenn sie eingeschlossen werden oder wenn sie gesammelt werden. Darüber hinaus sind die Blätter aus PDMS, die im wesentlichen hydrophob ist, aber Wassereinlagerungen durch Vermittlung von Hydrophilie des Materials erreicht werden kann. Die Wassereinlagerungen und Dicke sind günstige Eigenschaften der Wurm Blätter. Die Wassereinlagerungen Kapazität verhindert Austrocknung der Tiere nach längerer Immobilisierung und ermöglicht langfristige Beobachtungen durchgeführt werden.
Darüber hinaus sind bereits9beschrieben, die Blätter nur 300 µm dicken, schwere Ionen wie Kohlenstoff-Ionen (mit einer Reichweite von ca. 1 mm im Wasser) ermöglichen das Blatt umschließt die Tiere durchlaufen. Dadurch können die Ionen Teilchen erkannt werden und die angewandte Strahlendosis genau gemessen werden. Darüber hinaus die Wurm-Blätter können wiederverwendet werden und sind somit wirtschaftlich. Mit der herkömmlichen Injektionsverfahren die Tiere eingeschlossen sind manchmal tot und sie können nicht aus dem Kanal genommen werden; Ihre Eier können auch die Kanäle verstopfen. Dies macht den Chip unbrauchbar. Chips sind daher grundsätzlich Einweg und das Kosten-Nutzen-Verhältnis ist schlecht.
In der vorliegenden Arbeit beschreiben wir im Detail eine Reihe von Methoden für die auf dem Chip Immobilisierung von live C. Elegans Einzelpersonen mit Wurm Sheets. Durch Fortbewegung Proben von Tieren 3 h nach auf Chip Immobilisierung haben wir die geeigneten Abdeckfolie ausgewertet. Darüber hinaus haben wir die Beispiele der Immobilisierung auf dem Chip für bildgebende Beobachtungen und Microbeam Bestrahlung gezeigt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Auf dem Chip Immobilisierung von C. Elegans unter live-Bedingungen mit einem benetzbar PDMS-Mikrofluidik-Chip ermöglicht die effiziente zielgerichtete Microbeam Bestrahlung von mehreren Tieren. Die einfache Handhabung und Funktionen, um Austrocknen zu verhindern machen dieses System für Anwendungen geeignet, nicht nur in Microbeam Bestrahlung, sondern auch in mehreren Verhaltensstörungen Assays. Dieser Wurm Blätter haben bereits in den Handel gebracht worden und leicht zu erhalten. Konventionelle mikrofluidi…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Dr. Atsushi Higashitani für freundliche Beratung bezüglich der Behandlung von C. Elegans und DRS. Yuya Hattori, Yuichiro Yokota und Yasuhiko Kobayashi für wertvolle Diskussionen. Die Autoren danken den Caenorhabditis genetischen Center für die Bereitstellung von C. Elegans und E. Coli-Stämme. Wir danken die Crew des Zyklotrons TIARA bei QST-Takasaki für die freundliche Unterstützung bei der Bestrahlung Experimente. Wir danken Dr. Susan Furness zur Bearbeitung eines Entwurfs dieser Handschrift. Diese Studie wurde zum Teil durch KAKENHI (Grant-Nummern JP15K11921 und JP18K18839) von JSPS, M.S unterstützt
Materials
| C. elegans wild-type strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA | N2 | Wild-type C. elegans strain generally used in this study |
| C. elegans unc-119(e2498) III mutant strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA | CB4845 | C. elegans strain only employed as an example of mutants with abnormal body shape |
| C. elegans transgenic strain HBR4 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA | HBR4 | The genotype of this transgenic C. elegans strain is HBR4:goeIs3[pmyo-3::GCamP3.35:: unc-54–3’utr, unc-119(+)]V. This strain was only employed for imaging observation. |
| E. coli strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA | OP50 | E. coli strain used as food for C. elegans |
| Worm Sheet IR (50/60) | Biocosm, Inc., Hyogo, Japan | BCM17-0001 | Microfluidic chip with 25 straight 50/60-µm width channels used in all experiments and observation in this paper |
| Worm Sheet 60 | Biocosm, Inc., Hyogo, Japan | BCM18-0001 | Microfluidic chip with 20 straight 60 µm-width channels. This is sitable for adults 3-5 days after hatching at 20°C. |
| Worm Sheet 50 | Biocosm, Inc., Hyogo, Japan | BCM18-0002 | Microfluidic chip with 20 straight 50 µm-width channels. This is sitable for youg adults ~3 days after hatching at 20°C. |
| MICRO COVER GLASS | MATSUNAMI GLASS IND. LTD. | C030401 | Cover glass (thickness: 130-170 µm) used in locomotion assays in Protocol 3 |
| Polystyrene Film | Biocosm, Inc., Hyogo, Japan | BCM18-0001/ BCM18-0002 | Bundled items of Worm Sheets. PS filim (thickness: ~130 µm) used in locomotion assays in Protocol 3. |
| Polyester Film Lumirror | TORAY INDUSTRIES, INC., Tokyo, Japan | Lumirror T60 (t 125 µm) | PET filim (thickness: 125 µm) used in locomotion assays in Protocol 3 |
| IWAKI 60 mm/non-treated dish | AGC Techno Glass Co., Ltd., Shizuoka, Japan). | 1010-060 | Non-treated dish used in incuvation of C. elegans in Protocol 1 |
| IWAKI 35 mm/non-treated dish | AGC Techno Glass Co., Ltd., Shizuoka, Japan). | 1010-035 | Non-treated dish used in locomotion assays in Protocol 3 |
| Milli-Q | Merck, France | Ultrapure water | |
| Kimwipe S-200 | Nippon Paper Crecia Co., Ltd., Tokyo, Japan | 62020 | 120 mm x 215 mm; 200 sheets/ box |
| WormStuff Worm Pick | Genesee Scientific Corporation, CA, USA) | 59-AWP | Platina picker specilized for picking up C. elegans |
| Research Stereo Microscope System | OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan | SZX16 | Micriscope used in all experiments and observation in this paper |
| Motorized Focus Stand for SZX16 | OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan | SZX2-ILLB | This was used for bright field observation in Protocol 3-8. |
| Objective Lens (×1) | OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan | SDFPLAPO1×PF | NA: 0.15; W.D.: 60 mm. This lends was used for bright field observation in Protocol 3-8. |
| Objective Lens (×2) | OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan | SDFPLAPO2XPFC | NA: 0.3; W.D.: 20 mm. This lends was used for imaging observations. |
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