Иммобилизации живой Caenorhabditis elegans лиц с использованием ультратонкие полидиметилсилоксан Microfluidic чип с удержанием воды
Summary
Чтобы позволить целевой облучения живых Caenorhabditis elegans был создан ряд методов иммобилизации лиц с использованием недавно разработанных ультратонкий полидиметилсилоксан microfluidic чип с удержанием воды. Этот роман иммобилизации на чипе также является адекватным для визуализации наблюдений. Объяснил подробно лечения и примеры применения чипа.
Abstract
Излучение широко используется для биологических приложений и ионно лучевые размножения, и среди этих методов Микролучевой облучения представляет собой мощное средство идентификации радиочувствительным сайтов в живых организмах. Этот документ описывает ряд методов иммобилизации на чипе, разработанных для целевых Микролучевой облучения живых лиц Caenorhabditis elegans. В частности лечение чипов microfluidic полидиметилсилоксан (PDMS), которые мы ранее разработанных для иммобилизации C. elegans лиц без необходимости для анестезии, подробно. Этот чип, упоминаемый как червь лист, эластичные чтобы microfluidic каналы будет расширена, и эластичность позволяет животных, чтобы мягко обволакивает. Кроме того благодаря способности самостоятельной адсорбции PDMS, животные могут быть герметизированы в каналах, покрывая поверхности листа червя с тонкой обложки фильма, в котором животные не вставлен в каналы для корпуса. Путем поворачивать крышку пленку над, мы можем легко собирать животных. Кроме того червь лист показывает удержания воды и позволяет C. elegans лица могут подвергаться микроскопические наблюдения для длительных периодов под напряжением. Кроме того лист находится всего в 300 µm толщиной, позволяя тяжелых ионов, например ионов углерода пройти через лист, включающего животных, таким образом позволяя ионных частицы выявляться и прикладной лучевая точно измерить. Потому что выбор фильмов обложки, используемые для ограждающих животных очень важно для успешной долгосрочной иммобилизации, мы провели отбор подходящего покрытия фильмов и показан рекомендуемый один среди некоторых фильмов. В качестве примера приложения чипа мы ввели изображений наблюдения мышечной деятельности животных, включающего microfluidic канал червь листа, а также Микролучевой облучения. Эти примеры показывают, что червь листы значительно расширили возможности для биологических экспериментов.
Introduction
Излучения, в том числе рентген, гамма-лучи и тяжелых ионный луч, широко используется для биологических приложений, таких как в диагностика и лечение рака и ионно лучевые разведения. Многочисленные исследования и технические разработки в настоящее время сосредоточены на последствия радиации1,2,3. Микролучевой облучения является мощным средством выявления радиочувствительным сайтов в живых организмов4. Такасаки Advanced излучения исследовательский институт национальных институтов для квантовой и радиологической науки и техники (QST-Такасаки) занимается разработкой технологии чтобы облучить отдельных ячеек под микроскопические наблюдения с использованием тяжелых Ион microbeams5и создала методы, позволяющие целевых Микролучевой облучения нескольких модель животных, таких как нематоды Caenorhabditis elegans4,6, шелкопряда7и Oryzias latipes (японской оризии)8. Целевые Микролучевой облучения нематоды C. elegans позволяет эффективного нокдаун конкретных регионов, таких как нерв кольцо в регионе головы, тем самым помогая определить роли этих систем в ходе процессов таких как локомоции.
Чтобы позволить Микролучевой облучения4был разработан метод для иммобилизации на чипе C. elegans лиц без необходимости в анестезии. Кроме того чтобы улучшить microfluidic чипы используются в предыдущем исследовании4, мы недавно разработали смачиваемые, Ион проницаемые, полидиметилсилоксан (PDMS) microfluidic фишки, именуемые как червь листов (см. Таблицу материалы), для иммобилизирующие C. elegans лиц9. Они включают в себя ультра-тонких листов мягкой (толщина = 300 мкм; ширина = 15 мм; длина = 15 мм) с несколькими каналами (20 или 25) прямой microfluidic (глубина = 70 мкм; ширина = 60 мкм или 50 мкм; длина = 8 мм) на поверхности (рис. 1A-D). Microfluidic каналы являются открытыми и позволяют несколько животных, чтобы быть заключены в них одновременно (рис. 1E). Листы являются устойчивыми чтобы microfluidic каналы быть расширен (~ 10%, Рисунок 1F), и эластичность позволяет животных, чтобы мягко обволакивает. Кроме того благодаря способности самостоятельной адсорбции PDMS, животные могут быть герметизированы в каналах, покрывая поверхности листа червя с тонкой обложки фильма, в котором животные не вставлен в каналы для корпуса. Путем поворачивать крышку пленку над, мы можем легко собирать животных.
Каналы не повредит червей, когда они прилагаются или когда они собраны. Кроме того листы изготовлены из PDMS, который является по существу гидрофобная, но задержка воды может быть достигнуто путем придания гидрофильность материала. Удержания воды и толщины являются благоприятные характеристики червь листов. Мощность удержания воды предотвращает обезвоживание животных после длительной иммобилизации и позволяет долгосрочных наблюдений осуществляться.
Кроме того как было описано ранее9, листы являются лишь 300 µm толщиной, позволяя тяжелых ионов, например ионов углерода (с диапазоном около 1 мм в воде) пройти через лист, включающего животных. Это позволяет ионных частицы выявляться и прикладной лучевая точно измерить. Кроме того червь листы могут быть повторно использованы и таким образом являются экономичными. С помощью метода обычных инъекций животные прилагается иногда мертвых, и они не могут быть приняты из канала; их яйца могут также закупоривают каналы. Это делает чип непригодными. Чипы, таким образом, в основном одноразовые и затрат выгод соотношение бедных.
В настоящем документе, мы подробно описать ряд методов для на чипе иммобилизации живой C. elegans лиц с использованием червь листов. Через локомоции анализов животных 3 ч после иммобилизации на чипе мы оценивали фильм подходящего покрытия. Кроме того мы показали примеры иммобилизации на чипе для визуализации замечания и Микролучевой облучения.
Protocol
Representative Results
Discussion
На чипе иммобилизации C. elegans живой условиях использование смачиваемые PDMS microfluidic чип позволяет эффективных целевых Микролучевой облучения несколько животных. Простота обработки и возможности для предотвращения высыхания сделать эту систему подходит для приложений, не только в М?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят д-р Ацуши Higashitani за добрые советы относительно лечения C. elegans и Drs. Юя Хаттори, Йичиро Йокота и Ясухико Кобаяши ценных дискуссий. Авторы благодарят Caenorhabditis генетический центр для предоставления штаммов C. elegans и E. coli. Мы благодарим экипаж циклотрон тиара QST-Такасаки за их любезное содействие с облучением экспериментов. Мы благодарим д-р Сьюзен Furness для редактирования проекта этой рукописи. Это исследование было поддержано в части KAKENHI (Грант номера JP15K11921 и JP18K18839) с JSP-Страницами для м.с.
Materials
| C. elegans wild-type strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA | N2 | Wild-type C. elegans strain generally used in this study |
| C. elegans unc-119(e2498) III mutant strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA | CB4845 | C. elegans strain only employed as an example of mutants with abnormal body shape |
| C. elegans transgenic strain HBR4 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA | HBR4 | The genotype of this transgenic C. elegans strain is HBR4:goeIs3[pmyo-3::GCamP3.35:: unc-54–3’utr, unc-119(+)]V. This strain was only employed for imaging observation. |
| E. coli strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA | OP50 | E. coli strain used as food for C. elegans |
| Worm Sheet IR (50/60) | Biocosm, Inc., Hyogo, Japan | BCM17-0001 | Microfluidic chip with 25 straight 50/60-µm width channels used in all experiments and observation in this paper |
| Worm Sheet 60 | Biocosm, Inc., Hyogo, Japan | BCM18-0001 | Microfluidic chip with 20 straight 60 µm-width channels. This is sitable for adults 3-5 days after hatching at 20°C. |
| Worm Sheet 50 | Biocosm, Inc., Hyogo, Japan | BCM18-0002 | Microfluidic chip with 20 straight 50 µm-width channels. This is sitable for youg adults ~3 days after hatching at 20°C. |
| MICRO COVER GLASS | MATSUNAMI GLASS IND. LTD. | C030401 | Cover glass (thickness: 130-170 µm) used in locomotion assays in Protocol 3 |
| Polystyrene Film | Biocosm, Inc., Hyogo, Japan | BCM18-0001/ BCM18-0002 | Bundled items of Worm Sheets. PS filim (thickness: ~130 µm) used in locomotion assays in Protocol 3. |
| Polyester Film Lumirror | TORAY INDUSTRIES, INC., Tokyo, Japan | Lumirror T60 (t 125 µm) | PET filim (thickness: 125 µm) used in locomotion assays in Protocol 3 |
| IWAKI 60 mm/non-treated dish | AGC Techno Glass Co., Ltd., Shizuoka, Japan). | 1010-060 | Non-treated dish used in incuvation of C. elegans in Protocol 1 |
| IWAKI 35 mm/non-treated dish | AGC Techno Glass Co., Ltd., Shizuoka, Japan). | 1010-035 | Non-treated dish used in locomotion assays in Protocol 3 |
| Milli-Q | Merck, France | Ultrapure water | |
| Kimwipe S-200 | Nippon Paper Crecia Co., Ltd., Tokyo, Japan | 62020 | 120 mm x 215 mm; 200 sheets/ box |
| WormStuff Worm Pick | Genesee Scientific Corporation, CA, USA) | 59-AWP | Platina picker specilized for picking up C. elegans |
| Research Stereo Microscope System | OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan | SZX16 | Micriscope used in all experiments and observation in this paper |
| Motorized Focus Stand for SZX16 | OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan | SZX2-ILLB | This was used for bright field observation in Protocol 3-8. |
| Objective Lens (×1) | OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan | SDFPLAPO1×PF | NA: 0.15; W.D.: 60 mm. This lends was used for bright field observation in Protocol 3-8. |
| Objective Lens (×2) | OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan | SDFPLAPO2XPFC | NA: 0.3; W.D.: 20 mm. This lends was used for imaging observations. |
References
- Funayama, T., Hamada, N., Sakashita, T., Kobayashi, Y. Heavy-Ion microbeams-development and applications in biological studies. IEEE Transactions on Plasma Science. 36 (4), 1432-1440 (2008).
- Tanaka, A., Shikazono, N., Hase, Y. Studies on biological effects of ion beams on lethality, molecular nature of mutation, mutation rate, and spectrum of mutation phenotype for mutation breeding in higher plants. Journal of Radiation Research. 51 (3), 223-233 (2010).
- Ghita, M., Fernandez-Palomo, C., Fukunaga, H., Fredericia, P. M., Schettino, G., Bräuer-Krisch, E., Butterworth, K. T., McMahon, S. J., Prise, K. M. Microbeam evolution: from single cell irradiation to pre-clinical studies. International Journal of Radiation Biology. 94 (8), 708-718 (2018).
- Suzuki, M., Hattori, Y., Sakashita, T., Yokota, Y., Kobayashi, Y., Funayama, T. Region-specific irradiation system with heavy-ion microbeam for active individuals of Caenorhabditis elegans. Journal of Radiation Research. 58 (6), 881-886 (2017).
- Funayama, T., Wada, S., Yokota, Y., Fukamoto, K., Sakashita, T., Taguchi, M., Kakizaki, T., Hamada, N., Suzuki, M., Furusawa, Y., Watanabe, H., Kiguchi, K., Kobayashi, Y. Heavy-ion microbeam system at JAEA-Takasaki for microbeam biology. Journal of Radiation Research. 49 (1), 71-82 (2008).
- Sugimoto, T., Dazai, K., Sakashita, T., Funayama, T., Wada, S., Hamada, N., Kakizaki, T., Kobayashi, Y., Higashitani, A. Cell cycle arrest and apoptosis in Caenorhabditis elegans germline cells following heavy-ion microbeam irradiation. International Journal of Radiation Biology. 82 (1), 31-38 (2006).
- Fukamoto, K., Shirai, K., Sakata, T., Sakashita, T., Funayama, T., Hamada, N., Wada, S., Kakizaki, T., Shimura, S., Kobayashi, Y., Kiguchi, K. Development of the irradiation method for the first instar silkworm larvae using locally targeted heavy-ion microbeam. Journal of Radiation Research. 48 (3), 247-253 (2007).
- Yasuda, T., Kamahori, M., Nagata, K., Watanabe-Asaka, T., Suzuki, M., Funayama, T., Mitani, H., Oda, S. Abscopal activation of microglia in embryonic fish brain following targeted irradiation with heavy-ion microbeam. International Journal of Molecular Sciences. 18 (7), 1-15 (2017).
- Suzuki, M., Sakashita, T., Hattori, Y., Yokota, Y., Kobayashi, Y., Funayama, T. Development of ultra-thin chips for immobilization of Caenorhabditis elegans in microfluidic channels during irradiation and selection of buffer solution to prevent dehydration. Journal of Neuroscience Methods. 306, 32-37 (2018).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Génétique. 77 (1), 71-94 (1974).
- Schwarz, J., Spies, J. P., Bringmann, H. Reduced muscle contraction and a relaxed posture during sleep-like Lethargus. Worm. 1 (1), 12-14 (2012).
- Saeki, S., Yamamoto, M., Iino, Y. Plasticity of chemotaxis revealed by paired presentation of a chemoattractant and starvation in the nematode Caenorhabditis elegans. Experimental Biology. 204, 1757-1764 (2001).
- Sawin, E. R., Ranganathan, R., Horvitz, H. R. C. elegans locomotory rate is modulated by the environment through a dopaminergic pathway and by experience through a serotonergic pathway. Neuron. 26 (3), 619-631 (2000).
- Momma, K., Homma, T., Isaka, R., Sudevan, S., Higashitan, A. Heat-induced calcium leakage causes mitochondrial damage in Caenorhabditis elegans body-wall muscles. Génétique. 206 (4), 1985-1994 (2017).
- Kerr, R. A. Imaging the activity of neurons and muscles. WormBook. 2, 1-13 (2006).
- Aubry, G., Lu, H. A perspective on optical developments in microfluidic platforms for Caenorhabditis elegans research. Biomicrofluidics. 8, 011301 (2014).
- Lumirror Catalog. TORAY Available from: https://www.toray.jp/films/en/products/pdf/lumirror.pdf (2018)
- Otobe, K., Itou, K., Mizukubo, T. Micro-moulded substrates for the analysis of structure-dependent behaviour of nematodes. Nematology. 6 (1), 73-77 (2004).
- Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
- Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Apfeld, J., Fontana, W., Whitesides, G. M. A microfabricated array of clamps for immobilizing and imaging C. elegans. Lab on a Chip. 7 (11), 1515-1523 (2007).
- Lockery, S. R., Lawton, K. J., Doll, J. C., Faumont, S., Coulthard, S. M., Thiele, T. R., Chronis, N., McCormick, K. E., Goodman, M. B., Pruitt, B. L. Artificial dirt: Microfluidic substrates for nematode neurobiology and behavior. Journal of Neurophysiology. 99 (6), 3136-3143 (2008).
- Gilleland, C. L., Rohde, C. B., Zeng, F., Yanik, M. F. Microfluidic immobilization of physiologically active Caenorhabditis elegans. Nature Protocols. 5 (12), 1888-1902 (2010).
- Fehlauer, H., Nekimken, A. L., Kim, A. A., Pruitt, B. L., Goodman, M. B., Krieg, M. Using a microfluidics device for mechanical stimulation and high resolution imaging of C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (132), e56530 (2018).
