Meten mondiale cellulaire Matrix Metalloproteinase en metabole activiteit in 3D Hydrogels
Summary
Hier, een protocol wordt gepresenteerd voor het inkapselen van en het kweken van cellen in poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogels matiemaatschappij met een fluorogenic matrix metalloproteinase (MMP)-afbreekbaar peptide. Cellulaire MMP en metabole activiteit wordt gemeten rechtstreeks vanaf de hydrogel culturen met behulp van een standaard microplate-lezer.
Abstract
Driedimensionale (3D) cel cultuur systemen recapituleren vaak nauwer in vivo cellulaire reacties en functies dan traditionele tweedimensionale (2D) cultuur systemen. Meting van de functie van de cel in 3D cultuur is echter vaak meer uitdagend. Veel biologische tests vereisen ophalen van celmateriaal die kan moeilijk in 3D culturen. Een manier om deze uitdaging is het ontwikkelen van nieuwe materialen die meting van de functie van de cel binnen het materiaal in staat te stellen. Hier wordt een methode gepresenteerd voor meting van cellulaire matrix metalloproteinase (MMP) activiteit in 3D hydrogels in een 96-Wells-indeling. In dit systeem, is een poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogel matiemaatschappij met een fluorogenic MMP cleavable sensor. Cellulaire MMP activiteit is evenredig aan de intensiteit van de fluorescentie en kan worden gemeten met een standaard microplate-lezer. Miniaturisatie van deze test naar een 96-Wells-formaat beperkt de tijd die nodig is voor experimentele instellen door gebruik van 50% en reagens met 80% per voorwaarde ten opzichte van de vorige versie van de 24-well van de bepaling. Deze bepaling is ook compatibel met andere metingen van cellulaire functie. Bijvoorbeeld is een bepaling van de metabole activiteit hier gedemonstreerd, die gelijktijdig kunnen worden uitgevoerd met MMP activiteit metingen binnen de dezelfde hydrogel. De bepaling is aangetoond met menselijke melanoom cellen ingekapseld in een heel scala van cel zaaien dichtheden om te bepalen van de dichtheid van de passende inkapseling voor het werkbereik van de bepaling. MMP en metabole activiteit uitlezingen waren na 24u voor de inkapseling van de cel, evenredig naar cel zaaien dichtheid. Terwijl de bepaling wordt hier aangetoond met een fluorogenic afbreekbaar substraat, de assay en methodologie kunnen worden aangepast voor een breed scala aan hydrogel systemen en andere tl sensoren. Een dergelijke bepaling biedt een praktische, efficiënte en toegankelijke 3D kweken platform voor een breed scala van toepassingen.
Introduction
Driedimensionale (3D) cultuur systemen vaak nauwer recapituleren in vivo cellulaire reacties dan traditionele tweedimensionale (2D) cultuur systemen, zie verschillende uitstekende publicaties1,–2,3 . Echter met behulp van 3D cultuur systemen voor het meten van de functie cel heeft zijn uitdagend als gevolg van de moeilijkheid van cellulaire ophalen en genieten van verdere verwerking. Dit probleem beperkt de meting van vele cellulaire functies in 3D cultuur systemen. Overwinnen van deze problemen, nieuwe technieken waarmee gemakkelijk meting van de functie van de cel binnen 3D omgevingen nodig zijn. Een manier om deze behoefte is de ontwikkeling van materialen die 3D-celkweek ondersteunen niet alleen maar ook het opnemen van sensoren voor het meten van de functie cel. Bijvoorbeeld, hebben verschillende hydrogel systemen fluorogenic protease cleavable wordt zodat de visualisatie van protease-activiteit binnen 3D omgevingen4,,5,,6,7opgenomen. Terwijl deze systemen oorspronkelijk voor microscopische beeldvorming gebruikt werden, kunnen deze systemen ook worden aangepast voor gebruik in een globale matrix metalloproteinase (MMP) activiteit assay met behulp van een standaard afleesapparaat, facile meting van een functie van de cel in een 3D inschakelen milieu8.
MMP, een superfamilie van zink proteasen, spelen belangrijke rol in normale weefsel homeostase en vele ziekten. MMP degraderen remodelleren van extracellulaire matrix (ECM), klieven oppervlakte cel receptoren en cytokines en andere MMP9,10te activeren. MMP spelen belangrijke rol in de fysiologische processen zoals wondgenezing en ziekten zoals artritis, aderverkalking, Alzheimer en kanker (Bekijk beoordelingen in 9,10,11). Bij kanker, zijn hoge MMP expressie niveaus sterk gecorreleerd met kanker uitzaaiingen en slechte prognose12. Bovendien bijdragen MMP aan de progressie van de tumor door kanker cel invasie en migratie, cellulaire processen die inherent 3D verschijnselen13,14te bevorderen. Daarom is er veel interesse in de mogelijkheid voor het meten van MMP activiteit in 3D cultuur in vele contexten, met inbegrip van fundamentele biologische studies en drug screening tests.
PEG hydrogels worden veel gebruikt voor 3D-celkweek als gevolg van hun hoog watergehalte, weerstand tegen eiwit adsorptie en afstembare aard. PEG hydrogels hebben matiemaatschappij met een aantal wordt naar de functie van de directe cel, zoals met ECM mimetische peptiden zoals RGD RLD en IKVAV te vergemakkelijken van cel adhesie, of het direct binden van groeifactoren zoals transformeren groeifactor-β (TGF-β) 15,16. Meer recentelijk hebben PEG hydrogels matiemaatschappij is met sensor peptiden waarmee de meting van de functie cel als goed5,8. Met name het gebruik van een PEG hydrogel systeem met een fluorogenic MMP-afbreekbaar peptide ingeschakeld meten van cellulaire MMP-activiteiten in 3D culturen met een standaard-afleesapparaat matiemaatschappij en vereist geen verdere verwerking. Deze systemen zijn ook compatibel met andere metingen van cellulaire functie, met inbegrip van de metabole activiteit. Hier, wordt een protocol beschreven voor de meting van MMP activiteit van cellen gekweekt in een 3D-PEG hydrogel matiemaatschappij met een fluorogenic MMP-afbreekbaar peptide en resultaten te tonen van de experimenten van de eerste optimalisatie nodig voor gebruik van dit assay. Menselijke melanoom cellen (A375) werden ingekapseld in de hydrogels fluorogenic over een bereik van zaaien dichtheden om te bepalen van de juiste seeding dichtheden die binnen het werkbereik van de bepaling. Na 24u voor de inkapseling, werden MMP en metabole activiteit gemeten met behulp van een standaard microplate-lezer. Vervolgens werd MMP activiteit op metabole activiteit om te bepalen van de seeding dichtheden binnen het lineaire bereik van de bepaling genormaliseerd. Ten slotte, intra-plaat coëfficiënt van de variatie percentages (% CV) werden berekend tussen triplicates om na te denken van de reproduceerbaarheid van de verkregen resultaten. Deze methode kan eenvoudig en snel 3D-celkweek en eenvoudig meten van protease-activiteiten met minimal steekproef verwerking.
Protocol
Representative Results
Discussion
3D in vitro celkweek recapituleert veel belangrijke aspecten van het in vivo milieu. Echter, 3D cultuur maakt ook beoordeling functie van de cel en signalering uitdagend, zoveel biologische tests vereisen cellulaire ophalen en grote aantallen cellen. Dus, de ontwikkeling van een cultuur van eenvoudige 3D-systeem waarmee meting van cellulaire functie zonder verdere monster verwerking zou aanzienlijk vergroten het nut van 3D cultuur systemen. De 3D systeem hier beschreven kan worden aangepast voor een scala aan verschillen…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs wil erkennen Ohio kanker onderzoek (OCR), OH, Verenigde Staten voor de financiering van deze werkzaamheden, alsmede de Koning Saud Universiteit (KSU), Riyad, KSA voor het sponsoren van de eerste auteur. Moleculair gewicht van de fluorescerende peptide sensor werd gemeten met behulp van de matrix bijgestaan, laser desorptie-ionisatie, time-of-flight massaspectrometrie (MALDI-TOF) met hulp van de Campus chemische Instrument Center massaspectrometrie en Proteomics Faciliteit aan de Ohio State University.
Materials
| 1X Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | 10-010-049 | |
| Activated charcoal | Sigma-Aldrich | C3345 | |
| Black round bottom 96-well plate | Brand-Tech | 89093-600 | |
| Cell adhesion peptide (CRGDS) | GenScript USA Inc. | custom made | |
| Collagenase enzyme type I | Life Technologies | 17100-017 | |
| Dextran | Sigma-Aldrich | D4876 | |
| DMEM High Glucose Media | Invitrogen | 11965118 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Seradigm | 1500-500 | |
| Fluorescence microplate reader | BioTek | Cytation 3 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific Co. | 3200 | |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030-081 | |
| MMP-degradable peptide crosslinker (KCGPQG↓IWGQCK) | GenScript USA Inc. | custom made | |
| NaOH | Fisher Scientific | S318500 | |
| Penicillin /streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Resazurin (Alamar Blue) | Life Technologies | DAL1100 | |
| UV light | UVP | 95-0006-02 |
References
- Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension – how 3D culture microenvironments alter cellular cues. Journal of Cell Science. 125 (13), 3015-3024 (2012).
- Duval, K., et al. Modeling Physiological Events in 2D vs. 3D Cell Culture. Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).
- Hoarau-Véchot, J., Rafii, A., Touboul, C., Pasquier, J. Halfway between 2D and Animal Models: Are 3D Cultures the Ideal Tool to Study Cancer-Microenvironment Interactions. International Journal of Molecular Sciences. 19 (1), (2018).
- Lee, S. -. H., Miller, J. S., Moon, J. J., West, J. L. Proteolytically Degradable Hydrogels with a Fluorogenic Substrate for Studies of Cellular Proteolytic Activity and Migration. Biotechnology Progress. 21 (6), 1736-1741 (2005).
- DeForest, C. A., Polizzotti, B. D., Anseth, K. S. Sequential click reactions for synthesizing and patterning three-dimensional cell microenvironments. Nature Materials. 8 (8), 659-664 (2009).
- Chalasani, A., et al. Live-Cell Imaging of Protease Activity: Assays to Screen Therapeutic Approaches. Methods in Molecular Biology. 1574, 215-225 (2017).
- Jedeszko, C., Sameni, M., Olive, M., Moin, K., Sloane, B. F. Visualizing Protease Activity in Living Cells: From Two Dimensions to Four Dimensions. Current Protocols in Cell Biology. 04, (2008).
- Leight, J. L., Alge, D. L., Maier, A. J., Anseth, K. S. Direct measurement of matrix metalloproteinase activity in 3D cellular microenvironments using a fluorogenic peptide substrate. Biomaterials. 34 (30), 7344-7352 (2013).
- Nagase, H., Visse, R., Murphy, G. Structure and function of matrix metalloproteinases and TIMPs. Cardiovascular Research. 69 (3), 562-573 (2006).
- Tokito, A., Jougasaki, M., Tokito, A., Jougasaki, M. Matrix Metalloproteinases in Non-Neoplastic Disorders. International Journal of Molecular Sciences. 17 (7), 1178 (2016).
- Visse, R., Nagase, H. Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases: structure, function, and biochemistry. Circulation Research. 92 (8), 827-839 (2003).
- Vihinen, P., Kähäri, V. -. M. Matrix metalloproteinases in cancer: Prognostic markers and therapeutic targets. International Journal of Cancer. 99 (2), 157-166 (2002).
- Yodkeeree, S., Garbisa, S., Limtrakul, P. Tetrahydrocurcumin inhibits HT1080 cell migration and invasion via. downregulation of MMPs and uPA1. APHS Acta Pharmacologica Sinica. 29 (7), 853-860 (2008).
- Yodkeeree, S., Chaiwangyen, W., Garbisa, S., Limtrakul, P. Curcumin, demethoxycurcumin and bisdemethoxycurcumin differentially inhibit cancer cell invasion through the down-regulation of MMPs and uPA. The Journal of Nutritional Biochemistry. 20 (2), 87-95 (2009).
- Mabry, K. M., Schroeder, M. E., Payne, S. Z., Anseth, K. S. Three-Dimensional High-Throughput Cell Encapsulation Platform to Study Changes in Cell-Matrix Interactions. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (34), 21914-21922 (2016).
- Sridhar, B. V., Doyle, N. R., Randolph, M. A., Anseth, K. S. Covalently tethered TGF-β1 with encapsulated chondrocytes in a PEG hydrogel system enhances extracellular matrix production. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 102 (12), 4464-4472 (2014).
- Sridhar, B. V., et al. Development of a cellularly degradable PEG hydrogel to promote articular cartilage extracellular matrix deposition. Advanced Healthcare Materials. 4 (5), 702-713 (2015).
- Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility. Biomaterials. 30 (35), 6702-6707 (2009).
- Mucha, A., et al. Membrane Type-1 Matrix Metalloprotease and Stromelysin-3 Cleave More Efficiently Synthetic Substrates Containing Unusual Amino Acids in Their P1′ Positions. Journal of Biological Chemistry. 273 (5), 2763-2768 (1998).
- Chai, S. C., Goktug, A. N., Chen, T. Assay Validation in High Throughput Screening – from Concept to Application. Drug Discovery and Development. , (2015).
- Iversen, P. W., et al. HTS Assay Validation. Assay Guidance Manual. , (2004).
- Leight, J. L., Tokuda, E. Y., Jones, C. E., Lin, A. J., Anseth, K. S. Multifunctional bioscaffolds for 3D culture of melanoma cells reveal increased MMP activity and migration with BRAF kinase inhibition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (17), 5366-5371 (2015).
- Patterson, J., Hubbell, J. A. Enhanced proteolytic degradation of molecularly engineered PEG hydrogels in response to MMP-1 and MMP-2. Biomaterials. 31 (30), 7836-7845 (2010).
