מדידת הסלולר העולמי מטריקס מטאלו-פרוטאינאז ופעילות מטבולית Hydrogels תלת-ממד
Summary
. הנה, פרוטוקול מוצג לבצע, culturing בתאי poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogels functionalized עם fluorogenic מטריקס מטאלו-פרוטאינאז (MMP)-פפטיד מתכלה. MMP הסלולר ופעילות מטבולית נמדדים ישירות מן התרבויות הידרוג שימוש בקורא microplate סטנדרטיים.
Abstract
מערכות התרבות התא תלת מימדי (3D) לעיתים קרובות באופן הדוק יותר מסכם את הדברים ויוו תגובות הסלולר ופונקציות מאשר מערכות התרבות המסורתית (2D) דו מימדי. עם זאת, מדידה של הפונקציה תא בתרבות 3D לעתים קרובות יותר מאתגר. מבחני ביולוגיים רבים דורשים שליפת חומר הסלולר אשר יכול להיות קשה בתרבויות תלת-ממד. דרך אחת בהתמודדות עם אתגר זה הוא לפתח חומרים חדשים המאפשרים מדידה של התא פונקציה בתוך החומר. כאן מוצגת שיטה למדידה של הסלולר מטריקס מטאלו-פרוטאינאז (MMP) פעילות hydrogels 3D בתבנית 96-ובכן. במערכת זו, הידרוג poly(ethylene glycol) (PEG) הוא functionalized עם חיישן cleavable MMP fluorogenic. פעילות תאית MMP פרופורציונליים לעוצמת קרינה פלואורסצנטית, ניתן למדוד עם קורא microplate רגיל. המזעור של זה וזמינותו לתבנית 96-ובכן מופחת הזמן הדרוש ניסיוני הגדר על ידי 50% ואת ריאגנט השימוש ב-80% לכל תנאי לעומת הגירסה הקודמת 24-טוב של וזמינותו. Assay הזה הוא גם תואם עם מדידות אחרות של תפקוד התאים. לדוגמה, וזמינותו פעילות חילוף החומרים הוא הפגין כאן, אשר יכול להתבצע בו זמנית עם MMP מדידות פעילות בתוך הידרוג אותו. וזמינותו הוא הפגין עם תאי מלנומה אנושית אנקפסולציה לרוחב טווח של תאים זריעה צפיפויות לקביעת צפיפות כימוס המתאים עבור טווח עבודה וזמינותו. לאחר 24 שעות של כימוס תא, MMP פעילות חילוף החומרים הקריאות הבאות היו ביחס לתא זריעה צפיפות. בעוד וזמינותו היא המודגמות כאן עם אחד fluorogenic מתכלה סובסטרט, וזמינותו של מתודולוגיה יכול להיות מותאם עבור מגוון רחב של הידרוג מערכות וחיישנים פלורסנט אחרים. כזה assay מספק פלטפורמה culturing 3D פרקטי, יעיל ונגיש בקלות עבור מגוון רחב של יישומים.
Introduction
תרבות תלת מימדי (3D) מערכות לעיתים קרובות באופן הדוק יותר מסכם את הדברים ויוו תגובות סלולרית מאשר מערכות התרבות המסורתית (2D) דו מימדי, ראו מספר פרסומים מעולה1,2,3 . אולם, ניצול מערכות התרבות תלת-ממד כדי למדוד את תפקוד התא מאתגרת בשל הקושי של אחזור הסלולר, לטעום עוד יותר עיבוד. הקושי הזה מגביל את המדידה של תאיים רבים במערכות תרבות תלת-ממד. כדי להתגבר על הקושי הזה, טכניקות חדשות הדרושים המאפשרים מדידה קלה של התא פונקציה בתוך סביבות תלת-ממד. דרך אחת לטפל הצורך הזה היא הפיתוח של חומרים לא רק לתמוך תרבית תאים תלת-ממד, אך גם לשלב חיישנים למדידת תפקוד התא. לדוגמה, מספר מערכות הידרוג שילבו fluorogenic פרוטאז moieties cleavable כדי לאפשר ויזואליזציה של פרוטאז פעילות בתוך סביבות תלת-ממד4,5,6,7. בעוד שמערכות אלה נוצלו במקור עבור הדמיה מיקרוסקופיים, מערכות אלו ניתן להתאים גם לשימוש במטריקס גלובל מטאלופרוטאז (MMP) פעילות assay שימוש בקורא צלחת רגילה, המאפשרים מדידה נתיישב של פונקציה תא ב- 3D הסביבה8.
MMPs, superfamily של אבץ פרוטאזות, לשחק תפקידים חיוניים הרקמות הומאוסטזיס, מחלות רבות. MMPs לבזות לשפץ מטריצה חוץ-תאית (ECM), קליב קולטני פני שטח התא ציטוקינים, להפעיל אחרים MMPs9,10. MMPs לשחק תפקידים חיוניים תהליכים פיזיולוגיים כגון ריפוי הפצע, מחלות כמו דלקת פרקים, טרשת עורקים, אלצהיימר וסרטן (ראה הדעת 9,10,11). ב סרטן, רמות גבוהות של הביטוי MMP חריפה בקורלציה עם גרורות סרטן, פרוגנוזה12. יתר על כן, MMPs לתרום התקדמות הגידול באמצעות קידום סרטן התא הפלישה והעברה, תהליכים תאיים כי הם תופעות 3D מטבעו13,14. לכן, יש עניין רב היכולת למדוד פעילות MMP בתרבות 3D בהקשרים רבים, כולל מחקרים ביולוגיים בסיסיים, סמים הקרנת מבחני.
פג hydrogels נמצאים בשימוש נרחב עבור תרבית תאים 3D בשל תוכנם מים גבוהה, עמידות חלבון ספיחה, והטבע tunable. פג hydrogels יש כבר functionalized עם מספר moieties לתפקוד התא ישיר, כגון עם פפטידים מימטי ECM כמו RGD, שהכנסתי IKVAV כדי להקל על הידבקות תאים או ישיר. קשירת של גורמי גדילה כגון הפיכת גורם גידול-β (TGF-β) 15,16. לאחרונה, יש כבר functionalized פג hydrogels עם פפטידים חיישן המאפשרים מדידה של התא תפקוד טוב5,8. באופן ספציפי, השימוש של מערכת הידרוג פג functionalized עם fluorogenic MMP-מתכלים פפטיד מופעלת מדידה של פעילות תאית MMP בתרבויות 3D עם קורא צלחת רגילה, נדרש ללא עיבוד נוסף. מערכות אלה תואמים גם מדדים אחרים של תפקוד התאים, לרבות פעילות חילוף החומרים. . הנה, פרוטוקול מתואר לשקילת MMP פעילות של תאים תרבותי של הידרוג פג 3D functionalized עם פפטיד MMP-מתכלים fluorogenic ותוצאות הציג הממחיש את הניסויים אופטימיזציה הראשונית צורך להשתמש בזה וזמינותו. בתאי מלנומה אנושיים (A375) היו במארז hydrogels fluorogenic על פני טווח של זריעה צפיפויות כדי לקבוע הצפיפויות זריעה המתאים שנמצאים בטווח עבודה של וזמינותו. לאחר 24 שעות של כימוס, MMP ופעילות מטבולית נמדדו ניצול קורא microplate רגיל. בשלב הבא, פעילות MMP היה מנורמל לפעילות מטבולית כדי לקבוע את צפיפויות זריעה בתוך הטווח. ליניארית של וזמינותו. לבסוף, מקדם אינטרה-צלחת של וריאציה אחוזים (% CV) חושבו בין triplicates כדי לשקף את הפארמצבטית של התוצאות שהושג. שיטה זו מאפשרת תרבית תאים 3D פשוטה ומהירה, או מידה קלה של פרוטאז פעילות עם עיבוד מינימלי מדגם.
Protocol
Representative Results
Discussion
תרבית תאים במבחנה 3D recapitulates רבות היבטים חשובים של הסביבה ויוו. אולם, תרבות 3D עושה גם להערכת תפקוד התא, איתות מאתגר, מבחני ביולוגיות רבות דורשות אחזור הסלולר ואת מספר גדול של תאים. לפיכך, הפיתוח של מערכת פשוטה תרבות 3D המאפשר מדידה של תפקוד התאים ללא דוגמה נוספת עיבוד להגדיל באופן משמעותי את ה?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצה להכיר אוהיו סרטן מחקר (OCR), הו, בארה”ב למימון עבודה זו, כמו גם המלך סעוד האוניברסיטה (KSU), ריאד, KSA עבור המממנת המחבר הראשון. משקל מולקולרי של החיישן ניאון פפטידים נמדדה באמצעות מטריצת בסיוע, לייזר desorption-יינון, ספקטרומטר מסה (MALDI-TOF) זמן-של-טיסה עם סיוע מן הקמפוס כימי כלי מרכז ספקטרומטריית פרוטאומיקס מתקן ב אוניברסיטת מדינת אוהיו.
Materials
| 1X Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | 10-010-049 | |
| Activated charcoal | Sigma-Aldrich | C3345 | |
| Black round bottom 96-well plate | Brand-Tech | 89093-600 | |
| Cell adhesion peptide (CRGDS) | GenScript USA Inc. | custom made | |
| Collagenase enzyme type I | Life Technologies | 17100-017 | |
| Dextran | Sigma-Aldrich | D4876 | |
| DMEM High Glucose Media | Invitrogen | 11965118 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Seradigm | 1500-500 | |
| Fluorescence microplate reader | BioTek | Cytation 3 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific Co. | 3200 | |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030-081 | |
| MMP-degradable peptide crosslinker (KCGPQG↓IWGQCK) | GenScript USA Inc. | custom made | |
| NaOH | Fisher Scientific | S318500 | |
| Penicillin /streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Resazurin (Alamar Blue) | Life Technologies | DAL1100 | |
| UV light | UVP | 95-0006-02 |
References
- Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension – how 3D culture microenvironments alter cellular cues. Journal of Cell Science. 125 (13), 3015-3024 (2012).
- Duval, K., et al. Modeling Physiological Events in 2D vs. 3D Cell Culture. Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).
- Hoarau-Véchot, J., Rafii, A., Touboul, C., Pasquier, J. Halfway between 2D and Animal Models: Are 3D Cultures the Ideal Tool to Study Cancer-Microenvironment Interactions. International Journal of Molecular Sciences. 19 (1), (2018).
- Lee, S. -. H., Miller, J. S., Moon, J. J., West, J. L. Proteolytically Degradable Hydrogels with a Fluorogenic Substrate for Studies of Cellular Proteolytic Activity and Migration. Biotechnology Progress. 21 (6), 1736-1741 (2005).
- DeForest, C. A., Polizzotti, B. D., Anseth, K. S. Sequential click reactions for synthesizing and patterning three-dimensional cell microenvironments. Nature Materials. 8 (8), 659-664 (2009).
- Chalasani, A., et al. Live-Cell Imaging of Protease Activity: Assays to Screen Therapeutic Approaches. Methods in Molecular Biology. 1574, 215-225 (2017).
- Jedeszko, C., Sameni, M., Olive, M., Moin, K., Sloane, B. F. Visualizing Protease Activity in Living Cells: From Two Dimensions to Four Dimensions. Current Protocols in Cell Biology. 04, (2008).
- Leight, J. L., Alge, D. L., Maier, A. J., Anseth, K. S. Direct measurement of matrix metalloproteinase activity in 3D cellular microenvironments using a fluorogenic peptide substrate. Biomaterials. 34 (30), 7344-7352 (2013).
- Nagase, H., Visse, R., Murphy, G. Structure and function of matrix metalloproteinases and TIMPs. Cardiovascular Research. 69 (3), 562-573 (2006).
- Tokito, A., Jougasaki, M., Tokito, A., Jougasaki, M. Matrix Metalloproteinases in Non-Neoplastic Disorders. International Journal of Molecular Sciences. 17 (7), 1178 (2016).
- Visse, R., Nagase, H. Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases: structure, function, and biochemistry. Circulation Research. 92 (8), 827-839 (2003).
- Vihinen, P., Kähäri, V. -. M. Matrix metalloproteinases in cancer: Prognostic markers and therapeutic targets. International Journal of Cancer. 99 (2), 157-166 (2002).
- Yodkeeree, S., Garbisa, S., Limtrakul, P. Tetrahydrocurcumin inhibits HT1080 cell migration and invasion via. downregulation of MMPs and uPA1. APHS Acta Pharmacologica Sinica. 29 (7), 853-860 (2008).
- Yodkeeree, S., Chaiwangyen, W., Garbisa, S., Limtrakul, P. Curcumin, demethoxycurcumin and bisdemethoxycurcumin differentially inhibit cancer cell invasion through the down-regulation of MMPs and uPA. The Journal of Nutritional Biochemistry. 20 (2), 87-95 (2009).
- Mabry, K. M., Schroeder, M. E., Payne, S. Z., Anseth, K. S. Three-Dimensional High-Throughput Cell Encapsulation Platform to Study Changes in Cell-Matrix Interactions. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (34), 21914-21922 (2016).
- Sridhar, B. V., Doyle, N. R., Randolph, M. A., Anseth, K. S. Covalently tethered TGF-β1 with encapsulated chondrocytes in a PEG hydrogel system enhances extracellular matrix production. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 102 (12), 4464-4472 (2014).
- Sridhar, B. V., et al. Development of a cellularly degradable PEG hydrogel to promote articular cartilage extracellular matrix deposition. Advanced Healthcare Materials. 4 (5), 702-713 (2015).
- Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility. Biomaterials. 30 (35), 6702-6707 (2009).
- Mucha, A., et al. Membrane Type-1 Matrix Metalloprotease and Stromelysin-3 Cleave More Efficiently Synthetic Substrates Containing Unusual Amino Acids in Their P1′ Positions. Journal of Biological Chemistry. 273 (5), 2763-2768 (1998).
- Chai, S. C., Goktug, A. N., Chen, T. Assay Validation in High Throughput Screening – from Concept to Application. Drug Discovery and Development. , (2015).
- Iversen, P. W., et al. HTS Assay Validation. Assay Guidance Manual. , (2004).
- Leight, J. L., Tokuda, E. Y., Jones, C. E., Lin, A. J., Anseth, K. S. Multifunctional bioscaffolds for 3D culture of melanoma cells reveal increased MMP activity and migration with BRAF kinase inhibition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (17), 5366-5371 (2015).
- Patterson, J., Hubbell, J. A. Enhanced proteolytic degradation of molecularly engineered PEG hydrogels in response to MMP-1 and MMP-2. Biomaterials. 31 (30), 7836-7845 (2010).
