Medición de metaloproteinasa de la matriz celular Global y actividad metabólica en hidrogeles 3D
Summary
Aquí, se presenta un protocolo para encapsular y cultivo de células en hidrogeles de poly(ethylene glycol) (PEG), funcionalizados con un fluorógenos matriz metaloproteinasa (MMP)-péptido degradable. MMP celular y actividad metabólica se miden directamente las culturas de hidrogel utilizando un lector de microplacas estándar.
Abstract
Sistemas de cultivo celular (3D) tridimensional a menudo más de cerca recapitulan en vivo respuestas celulares y funciones que los sistemas de dos dimensiones tradicionales de la cultura (2D). Sin embargo, medición de función de las células en cultura 3D suele ser más difícil. Muchos ensayos biológicos requieren recuperación de material celular que puede ser difícil en las culturas 3D. Una forma de enfrentar este desafío es desarrollar nuevos materiales que permitan la medición de función de la célula dentro del material. Aquí, se presenta un método para la medición de actividad de la metaloproteinasa (MMP) de matriz celular en hidrogeles 3D en un formato de 96 pozos. En este sistema, un hidrogel de poly(ethylene glycol) (PEG) es functionalized con sensor escindibles fluorógenos MMP. Actividad MMP celular es proporcional a la intensidad de fluorescencia y puede medirse con un lector de microplacas estándar. Miniaturización de este ensayo a un formato de 96 pocillos reduce el tiempo requerido para la instalación experimental por 50% y el reactivo de uso 80% condición en comparación con la versión anterior de 24 pocillos de ensayo. Este ensayo también es compatible con otras mediciones de la función celular. Por ejemplo, un análisis de la actividad metabólica es demostrado aquí, que puede realizarse simultáneamente con las mediciones de actividad de la MMP dentro el mismo hidrogel. El ensayo se demuestra con las células de melanoma humano encapsuladas en una gama de siembra la densidad para determinar la densidad de encapsulación apropiada para el rango de trabajo del ensayo de la célula. Después de 24 h de encapsulación de la célula, MMP y lecturas de la actividad metabólica fueron proporcionales a la densidad de siembra de la célula. Mientras que el ensayo se demuestra aquí con un substrato degradable fluorógenos, el ensayo y la metodología podrían ser adaptados para una gran variedad de sistemas de hidrogel y otros sensores fluorescentes. Tal un ensayo proporciona una plataforma de cultivo 3D práctica, eficiente y accesible para una amplia variedad de aplicaciones.
Introduction
Sistemas de cultivo (3D) tridimensional a menudo más de cerca recapitular en vivo respuestas celulares que los sistemas de cultivo (2D) dos dimensiones tradicionales, ver varias publicaciones excelente1,2,3 . Sin embargo, los sistemas de cultivo 3D para medir la función de la célula ha sido difícil debido a la dificultad de recuperación celular y más procesamiento de la muestra. Esta dificultad limita la medición de muchas funciones celulares en los sistemas de cultivo 3D. Para superar esta dificultad, nuevas técnicas son necesarias que permita la fácil medición de función de la célula dentro de entornos 3D. Una forma de responder a esta necesidad es el desarrollo de materiales que no sólo apoyan cultivo celular 3D sino también incorporar sensores para medir la función de la célula. Por ejemplo, varios sistemas de hidrogel han incorporado partes escindibles de la proteasa fluorógenos para habilitar la visualización de la actividad de las proteasas dentro de entornos 3D4,5,6,7. Mientras que estos sistemas fueron utilizados originalmente para la proyección de imagen microscópica, estos sistemas también pueden ser adaptados para su uso en un ensayo de actividad global de la matriz metaloproteinasa (MMP) utilizando un lector de placa estándar, que permite la medida fácil de una función de la célula en un 3D medio ambiente8.
MMPs, superfamilia de las proteasas de zinc, juegan un papel crítico en la homeostasis del tejido normal y en muchas enfermedades. MMPs degradan y remodelan la matriz extracelular (MEC), cleave citocinas y receptores de superficie celular y activan otras MMPs9,10. MMPs juegan un papel crítico en procesos fisiológicos tales como la cicatrización de heridas y en enfermedades como artritis, aterosclerosis, enfermedad de Alzheimer y cáncer (ver comentarios en 9,10,11). En el cáncer, altos niveles de expresión de la MMP se correlacionan fuertemente con metástasis de cáncer y mal pronóstico12. Además, MMPs contribuyen a la progresión del tumor mediante la promoción de cáncer células invasión y migración, procesos celulares que son fenómenos intrínsecamente 3D13,14. Por lo tanto, hay mucho interés en la capacidad para medir la actividad MMP en 3D cultura en muchos contextos, incluyendo estudios de Biología fundamentales y ensayos de detección de drogas.
Hidrogeles de PEG son ampliamente utilizados para el cultivo de celular 3D debido a su alto contenido de agua, resistencia a la adsorción de proteínas y la naturaleza armoniosa. Hidrogeles de PEG han sido funcionalizados con un número de fracciones en función directa de la célula, tales como con péptidos miméticos de ECM como RGD, RLD y IKVAV para facilitar la adhesión celular, o directamente tethering de factores de crecimiento tales como transformación de factor de crecimiento-β (TGF-β) 15,16. Más recientemente, hidrogeles PEG han sido funcionalizados con péptidos de sensores que permitan la medición de la función celular como bien5,8. Específicamente, el uso de un sistema de hidrogel PEG funcionalizados con un fluorógenos MMP-degradable medición de péptido activado de actividad celular de MMP en culturas 3D con un lector de placas estándar y no requiere ninguna transformación posterior. Estos sistemas también son compatibles con otras mediciones de la función celular, incluyendo la actividad metabólica. Aquí, se describe un protocolo para la medición de la actividad MMP de células cultivadas en un hidrogel de PEG 3D funcionalizados con un péptido MMP-degradable fluorógenos y resultados presentados demostrando los experimentos de optimización inicial necesarios para el uso de este ensayo. Células de melanoma humano (A375) fueron encapsuladas en los hidrogeles fluorógenos en un rango de densidades para determinar las densidades de siembra apropiadas que están dentro del rango de trabajo del ensayo de siembra. Después de 24 h de encapsulación, MMP y la actividad metabólica se midieron utilizando un lector de microplacas estándar. A continuación, actividad MMP fue normalizada a la actividad metabólica para determinar las densidades de siembra dentro del rango lineal del ensayo. Por último, coeficiente intra-placa de porcentajes de variación (% CV) se calcularon entre triplicados para reflejar la reproducibilidad de los resultados obtenidos. Este método permite cultivo celular 3D simple y rápido y fácil medición de la actividad de la proteasa con el procesamiento de la muestra mínima.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cultivo de células in vitro 3D recapitula muchos aspectos importantes del medio ambiente en vivo. Sin embargo, cultura 3D también hace evaluación de función celular y señalización desafiante, como muchos ensayos biológicos requieren recuperación celular y gran número de células. Por lo tanto, el desarrollo de un sistema de simple cultura 3D que permite la medición de la función celular sin muestra más procesamiento aumentaría enormemente la utilidad de los sistemas de cultivo 3D. El sistema 3D aquí descrit…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean reconocer Ohio cáncer investigación (OCR), OH, Estados Unidos para la financiación de este trabajo, así como Rey Saud University (KSU), Riyadh, KSA para patrocinar al primer autor. Peso molecular del sensor péptido fluorescente se midió usando matriz asistida, láser de desorción-ionización, espectrometría de masas (MALDI-TOF) tiempo de vuelo con la ayuda de la química instrumento Campus centro de espectrometría de masas y proteómica Instalación en la Universidad Estatal de Ohio.
Materials
| 1X Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | 10-010-049 | |
| Activated charcoal | Sigma-Aldrich | C3345 | |
| Black round bottom 96-well plate | Brand-Tech | 89093-600 | |
| Cell adhesion peptide (CRGDS) | GenScript USA Inc. | custom made | |
| Collagenase enzyme type I | Life Technologies | 17100-017 | |
| Dextran | Sigma-Aldrich | D4876 | |
| DMEM High Glucose Media | Invitrogen | 11965118 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Seradigm | 1500-500 | |
| Fluorescence microplate reader | BioTek | Cytation 3 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific Co. | 3200 | |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030-081 | |
| MMP-degradable peptide crosslinker (KCGPQG↓IWGQCK) | GenScript USA Inc. | custom made | |
| NaOH | Fisher Scientific | S318500 | |
| Penicillin /streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Resazurin (Alamar Blue) | Life Technologies | DAL1100 | |
| UV light | UVP | 95-0006-02 |
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