Kwantitatieve analyse van cellulaire samenstelling in geavanceerde atherosclerotische laesies van de gladde spieren cel Lineage-Tracing muizen
Summary
Wij stellen voor een gestandaardiseerde protocol karakteriseren de cellulaire samenstelling van laat-stadium lymfkliertest atherosclerotische laesies met inbegrip van systematische methoden voor dierlijke dissectie, weefsel insluiten, afdelen, kleuring en analyse van brachiocephalic slagaders van atheroprone gladde spieren cel lineage tracering muizen.
Abstract
Atherosclerose blijft de belangrijkste oorzaak van overlijden wereldwijd en, ondanks talloze Preklinische studies beschrijven van veelbelovende therapeutische doelen, gebleven roman interventies ongrijpbaar. Dit is waarschijnlijk, gedeeltelijk vanwege tot een afhankelijkheid van preklinische preventie modellen onderzoekt de gevolgen van genetische manipulaties of farmacologische behandelingen op atherosclerose ontwikkeling in plaats van de gevestigde ziekte. Ook zijn resultaten van deze studies vaak storende vanwege het gebruik van oppervlakkige laesie analyses en een gebrek aan karakterisering van laesie cel populaties. Om te helpen deze translationeel hindernissen overwinnen, stellen wij voor een verhoogde afhankelijkheid van interventie modellen die onderzoek naar veranderingen in cellulaire samenstelling op het niveau van een eencellige in door immunefluorescentie kleuring en confocale microscopie dienst. Te dien einde beschrijven we een protocol voor het testen van een vermeende therapeutische agent in een model van de lymfkliertest interventie met inbegrip van een systematische aanpak voor dierlijke dissectie, insluiten, afdelen, kleuring en kwantificering van brachiocephalic slagader laesies. Bovendien, als gevolg van de fenotypische verscheidenheid van cellen binnen de laat-stadium atherosclerotische laesies beschrijven we het belang van het gebruik van cel-specifieke, afleidbare bloedlijn tracering muis systemen en hoe dit kan worden benut voor onbevooroordeelde karakterisering van atherosclerotische laesies cel populaties. Samen, deze strategieën kunnen bijstaan vasculaire biologen nauwkeuriger model van therapeutische interventies en analyseren van atherosclerotische ziekten en hopelijk zal vertalen in een hoger tarief van succes in klinische proeven.
Introduction
Atherosclerose is de belangrijke oorzaak van morbiditeit en mortaliteit wereldwijd ten grondslag liggen aan de meerderheid van coronaire hartziekte, perifere slagader ziekten en beroerte. Alsnog coronaire atherosclerose kan leiden tot ernstige complicaties inclusief myocardiale overtreding boekhouding voor bijna 16% van de wereld bevolking sterfte1,2. Als gevolg van de verwoestende gevolgen voor de volksgezondheid, aanzienlijke inspanning geboekt te ontcijferen van de mechanismen van atherosclerose progressie, evenals rijden over het ontwikkelen van nieuwe therapeutische strategieën. Toch is het tarief van de waarschijnlijkheid van goedkeuring (LOA) van klinische proeven voor hart-en vaatziekten tot de laagste in vergelijking met andere klinische velden (slechts 8,7% voor fase I)3. Dit kan verklaard worden gedeeltelijk door vele obstakels die atherosclerose vormt voor efficiënte Geneesmiddelenontwikkeling, met inbegrip van haar bijna alomtegenwoordige aard, klinisch-stille progressie en belangrijke ziekte heterogeniteit. Bovendien, het suboptimaal ontwerp van preklinische dierstudies kan ook worden verklaard voor het gebrek aan succes in klinische vertaling. Wij vinden het in het bijzonder nodig voor de uitvoering van interventiestudies mogelijk te onderzoeken van de werkzaamheid van de therapeutische strategieën. Ook is er dringend behoefte aan gestandaardiseerde procedures uitvoeren voor laesie analyses, met inbegrip van geavanceerde karakterisering van laat-stadium atherosclerotische laesies cellulaire samenstelling door lot toewijzing en fenotypering.
De overgrote meerderheid van atherosclerose studies richten zich op modellen van atherosclerose preventie bestaande uit drug behandeling of genetische manipulatie (knock-out of knock-in) bij gezonde jonge muizen, voorafgaand aan de inleiding van de ziekte en de progressie. Deze studies hebben ontdekt een groot aantal genen en signalering moleculen die een rol in de ontwikkeling van atherosclerose spelen. Echter het merendeel van deze doelstellingen niet te vertalen naar efficiënte therapieën in de mens. Inderdaad, het is moeilijk te extrapoleren het effect dat een therapie op gezonde jonge muizen aan oudere patiënten met geavanceerde atherosclerotische laesies heeft. Als zodanig, zorgt de implementatie van interventiestudies in de preklinische experimentele pijpleiding waarschijnlijk voor een meer nauwkeurige voorstelling van de relevantie en doeltreffendheid van een nieuwe therapeutische. Het idee wordt ondersteund door de opvallend uiteenlopende effecten van remming van de pro-inflammatoire cytokine Interleukine-1β (IL-1β) als een preventie4,5,6 of interventie strategie7in dienst. Verschillen tussen preventie en interventiestudies suggereren dat verschillende cellulaire processen zich voordoen in verschillende fasen van de ontwikkeling van atherosclerose en wijst op het feit dat preventie studies waarschijnlijk zijn onvoldoende om het model van de klinische scenario voldoende.
De American Heart Association publiceerde onlangs een wetenschappelijke verklaring aanbevelingen voor goede proefopzet, procedurele normalisatie, analyse en rapportage van dierlijke atherosclerose studies8detaillering. Zij wijst op de voordelen en beperkingen van overheersende technieken die worden gebruikt in het veld. Nl gezicht Soedan IV kleuring van de aorta wordt bijvoorbeeld vaak uitgevoerd als een eerste uitlezing. Hoewel nl gezicht Soedan IV kleuring van lipide afzetting een geschikte methode voor de beoordeling van globale plaque last is, is het niet in staat om te onderscheiden van beginnende vette streep laesies van meer geavanceerde alsnog laesies. Als zodanig is de interpretatie van nl gezicht kleuring vaak dubbelzinnig en oppervlakkige9. Zorgvuldige analyse van weefsel doorsneden met behulp van de morfologische parameters vaartuig, laesie en lumen grootte en kwantificering van de indexcijfers van de laesie stabiliteit biedt een nauwkeuriger inzicht in het effect van een experiment.
Ten slotte, menselijke histopathologie studies hebben gesuggereerd dat cellulaire samenstelling een betere voorspeller van breuk dan de laesie grootte zelf, met laesies in de zachte spiercellen (SMC) armen en rijken in macrofagen wordt gevoeliger is voor scheuren10, 11. Deze opmerkingen waren gebaseerd op de kleuring voor markeringen klassiek gebruikt voor de identificatie van de cel (dat wil zeggen, ACTA2 voor SMC en LGALS3 of CD68 voor macrofagen). De uitdrukking van deze markeringen echter niet strikt beperkt tot een enkele celtype in atherosclerotische laesies als gevolg van de plasticiteit van meerdere lineages inclusief SMC, endotheliale cellen en myeloïde cellen12. In het bijzonder was de ondubbelzinnige identificatie van SMC binnen atherosclerotische laesies vrijwel onmogelijk tot de afgelopen tien jaar vanwege het eigendom van deze cellen te dedifferentiate en te bestraffen van hun geslacht-specifieke markers (een proces genoemd fenotypische schakelen) in13van de gewonde of zieke vaartuigen. Deze beperking in SMC identificatie heeft omzeild door de ontwikkeling van lineage tracering7,14,15,16,17,18, 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24. het bestaat uit het permanent etikettering SMC en hun nageslacht voor het bijhouden van hun lot en fenotypische evolutie tijdens atherosclerose progressie met behulp van een combinatie van de uitdrukking van Cre recombinase gedreven door SMC-specifieke initiatiefnemers (dat wil zeggen, Myh117,15,17,18,19,20,21,22,23 , 24,26 25, Acta2en, SM22α14,16) en de activering van verslaggevers (bijv. fluorescente proteïnen, β-galactosidase) [gerecenseerd in Bentzon en Majesky 201827]. In één van de eerste studies dienst SMC lineage tracering buiten embryogenese instelling, Speer et al.14 aangetoond dat SMC moduleren hun fenotype en transdifferentiate in chondrogenic cellen tijdens vasculaire verkalking met behulp van kunt een SM22α Cre R26R LacZ lineage tracering model. Hoewel deze studies pionier SMC lineage tracering, waren zij gedeeltelijk dubbelzinnig in die zin dat een bepaald niet-SMC waarin SM22α in het kader van de ziekte zou worden aangeduid door de verslaggever. Deze beperking is gepasseerd door de ontwikkeling en het gebruik van tamoxifen-afleidbare Cre ERT/LoxP toelaat een temporele controle van cel labeling. Cel labeling gebeurt uitsluitend tijdens tamoxifen levering en zal worden beperkt tot de uiting van de cel type-specifieke promotor rijden Cre ERT expressie op het moment van tamoxifen blootstelling, het vermijden van tracering van alternatieve celtypes activeren Cre in cel de instelling van progressie van de ziekte. Voor tracering van de bloedlijn van SMC in atherosclerose, de tamoxifen-afleidbare Myh11– Cre/ERT2 transgenic gekoppeld aan fluorescerende verslaggevers (eYFP7,15,17,18 , 21, mTmG19,25, Confetti20,22,23 voor klonen uitbreiding studies) heeft aangetoond een opmerkelijke efficiëntie en specificiteit in SMC labeling en heeft gebruikt om lot kaart SMC populaties in atherosclerotische laesies in recente studies. Nog belangrijker is, deze studies is gebleken dat: 1) 80% van de SMC binnen geavanceerde atherosclerotische laesies ken niet uitdrukkelijk elke conventionele SMC markeringen (ACTA2, MYH11) in immunohistological analyse gebruikt en daarom zou hebben is onrechte zonder afstamming tracering 17; 2) deelverzamelingen van SMC express markers van alternatieve celtypen, met inbegrip van macrofaag markeringen of mesenchymale stamcellen markeringen16,17,19; en 3) SMC investeren en vullen de atherosclerotische laesie door oligoclonale expansie en SMC klonen behouden plasticiteit overgang naar fenotypische verschillende bevolkingsgroepen20,23. Om samen te vatten, is het nu duidelijk dat de zachte spiercellen een opmerkelijke fenotypische verscheidenheid in atherosclerotische laesies presenteren en voordelig of nadelig rollen op laesie pathogenese afhankelijk van de aard van hun fenotypische overgangen hebben kunnen. Deze ontdekkingen vertegenwoordigen een opmerkelijke nieuwe therapeutische laan voor het targeten van SMC athero-bevordering van fenotypische overgangen in laat-stadium atherosclerose.
Hierin stellen wij een gestandaardiseerd protocol voor het analyseren van de late-stadium lymfkliertest atherosclerotische laesies waaronder systematische methoden voor dierlijke dissectie, insluiten, afdelen, kleuring en kwantificering van brachiocephalic slagader laesies. Hebben we gebruikt om te bepalen van het effect van Interleukine-1β remming op SMC lot en fenotype, SMC lineage traceren ApoE– / – muizen gevoed een westerse dieet gedurende 18 weken vóór de ontvangst van de wekelijkse injecties van een anti-IL1β antistof of isotype-matched IgG besturingselement.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ondanks decennia van onderzoek en technische vooruitgang bij het bestuderen van atherosclerose, heeft de veld een teleurstellend geschiedenis van voor het vertalen van wetenschappelijke bevindingen aan klinische therapieën34,35. Dit verschijnsel kan gedeeltelijk worden verklaard door verschillen in diermodellen, experimentele designs en analyses van de laesie. Hierin beschrijven we een experimentele pijpleiding die we gebruikt om te analyseren de cellulaire same…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken het centrum voor biologische Imaging (ondersteund door NIH 1S10OD019973-01) aan de Universiteit van Pittsburgh voor hun hulp. Dit werk werd gesteund door wordt ondersteund door wetenschappelijke ontwikkeling Grant 15SDG25860021 van de American Heart Association aan D.G. R.A.B. werd gesteund door NIH grant F30 HL136188.
Materials
| 16% Paraformaldehyde aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | RT 15710 | Tissue perfusion and fixation |
| 23G butterfly needle | Fisher | BD367342 | |
| 25G needle | Fisher | 14-821-13D | |
| A1 Confocal microscope | Nikon | Confocal microscope | |
| ACTA2-FITC antibody (mouse) | Sigma Aldrich | F3777 | Primary Antibody |
| Alexa-647 anti goat | Invitrogen | A-21447 | Secondary antibody |
| Antigen Unmasking solution, Citric acid based | Vector Labs | H-3300 | Antigen retrieval solution |
| Chow Diet | Harlan Teklad | TD.7012 | |
| Coverslip | Fisher | 12-544-14 | Any 50 x 24 mm cover glass |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | Nucleus fluorescent counterstaining |
| Donkey Alexa-488 anti-rabbit | Invitrogen | A-21206 | Secondary antibody |
| Donkey Alexa-555 anti-rat | Abcam | ab150154 | Secondary antibody |
| DPBS 10X without Calcium and Magnesium | Gibco | 14200166 | PBS for solution dilutions and washes. Dilute to 1x in deionized water |
| Embedding cassette | Fisher | 15-182-701D | |
| ETDA vacuum tube | Fisher | 02-685-2B | |
| Ethanol 200 proof | Decon | 2701 | |
| Foam pad | Fisher | 22-222-012 | |
| Gelatin from cold water fish skin | Sigma Aldrich | G7765 | |
| GFP antibody (goat) | abcam | ab6673 | Primary antibody |
| goat IgG control | Vector Labs | I-5000 | IgG control |
| High Fat Diet | Harlan Teklad | TD.88137 | |
| ImageJ | NIH | Computer program https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| LGALS3 antibody (rat) | Cedarlane | CL8942AP | Primary antibody |
| LSM700 confocal microscope | Zeiss | Confocal microscope | |
| Microscope Slides, Superfrost Plus | Fisher | 12-550-15 | |
| Microtome blades | Fisher | 30-538-35 | |
| Mouse IgG control | Vector Labs | I-2000 | IgG control |
| NIS element imaging software | Nikon | Imaging software for z-stack image acquisition | |
| Normal Horse serum | Sigma Aldrich | H1270 | |
| Pap Pen | Fisher | 50-550-221 | |
| Peanut oil | Sigma | P2144 | |
| Prolong gold Antifade mountant | Invitrogen | P36930 | Mounting medium |
| Rabbit IgG control | Vector Labs | I-1000 | IgG control |
| Rat IgG control | Vector Labs | I-4000 | IgG control |
| RUNX2 antibody (rabbit) | Abcam | ab192256 | Primary Antibody |
| Syringe | BD | 309628 | 1 ml syringe |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| Xylene | Fisher | X55K-4 | |
| Zen imaging software | Zeiss | Imaging software for z-stack image acquisition |
References
- GBD DALYs and HALE Collaborators. Global, regional, and national disability-adjusted life-years (DALYs) for 315 diseases and injuries and healthy life expectancy (HALE), 1990-2015: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2015. Lancet. 388 (10053), 1603-1658 (2016).
- Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2018 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 137 (12), 67-92 (2018).
- Hay, M., Thomas, D. W., Craighead, J. L., Economides, C., Rosenthal, J. Clinical development success rates for investigational drugs. Nature Biotechnology. 32 (1), 40-51 (2014).
- Bhaskar, V., et al. Monoclonal antibodies targeting IL-1 beta reduce biomarkers of atherosclerosis in vitro and inhibit atherosclerotic plaque formation in Apolipoprotein E-deficient mice. Atherosclerosis. 216 (2), 313-320 (2011).
- Isoda, K., et al. Lack of interleukin-1 receptor antagonist modulates plaque composition in apolipoprotein E-deficient mice. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 24 (6), 1068-1073 (2004).
- Kirii, H., et al. Lack of interleukin-1beta decreases the severity of atherosclerosis in ApoE-deficient mice. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 23 (4), 656-660 (2003).
- Gomez, D., et al. Interleukin-1β has atheroprotective effects in advanced atherosclerotic lesions of mice. Nature Medicine. 24, 1418-1429 (2018).
- Daugherty, A., et al. Recommendation on Design, Execution, and Reporting of Animal Atherosclerosis Studies: A Scientific Statement From the American Heart Association. Circulation Research. 121 (6), 53-79 (2017).
- Baylis, R. A., Gomez, D., Owens, G. K. Shifting the Focus of Preclinical, Murine Atherosclerosis Studies From Prevention to Late-Stage Intervention. Circulation Research. 120 (5), 775-777 (2017).
- Kolodgie, F. D., et al. Pathologic assessment of the vulnerable human coronary plaque. Heart. 90 (12), 1385-1391 (2004).
- Virmani, R., Kolodgie, F. D., Burke, A. P., Farb, A., Schwartz, S. M. Lessons from sudden coronary death: a comprehensive morphological classification scheme for atherosclerotic lesions. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 20 (5), 1262-1275 (2000).
- Gomez, D., Owens, G. K. Smooth muscle cell phenotypic switching in atherosclerosis. Cardiovascular Research. 95 (2), 156-164 (2012).
- Owens, G. K., Kumar, M. S., Wamhoff, B. R. Molecular regulation of vascular smooth muscle cell differentiation in development and disease. Physiological Reviews. 84 (3), 767-801 (2004).
- Speer, M. Y., et al. Smooth muscle cells give rise to osteochondrogenic precursors and chondrocytes in calcifying arteries. Circulation Research. 104 (6), 733-741 (2009).
- Gomez, D., Shankman, L. S., Nguyen, A. T., Owens, G. K. Detection of histone modifications at specific gene loci in single cells in histological sections. Nature Methods. 10 (2), 171-177 (2013).
- Feil, S., et al. Transdifferentiation of vascular smooth muscle cells to macrophage-like cells during atherogenesis. Circulation Research. 115 (7), 662-667 (2014).
- Shankman, L. S., et al. KLF4-dependent phenotypic modulation of smooth muscle cells has a key role in atherosclerotic plaque pathogenesis. Nature Medicine. 21, 628 (2015).
- Cherepanova, O. A., et al. Activation of the pluripotency factor OCT4 in smooth muscle cells is atheroprotective. Nature Medicine. 22, 657 (2016).
- Albarran-Juarez, J., Kaur, H., Grimm, M., Offermanns, S., Wettschureck, N. Lineage tracing of cells involved in atherosclerosis. Atherosclerosis. 251, 445-453 (2016).
- Chappell, J., et al. Extensive Proliferation of a Subset of Differentiated, yet Plastic, Medial Vascular Smooth Muscle Cells Contributes to Neointimal Formation in Mouse Injury and Atherosclerosis Models. Circulation Research. 119 (12), 1313-1323 (2016).
- Newman, A. A., et al. Irradiation abolishes smooth muscle investment into vascular lesions in specific vascular beds. JCI Insight. 3 (15), (2018).
- Dobnikar, L., et al. Disease-relevant transcriptional signatures identified in individual smooth muscle cells from healthy mouse vessels. Nature Communications. 9 (1), 4567 (2018).
- Misra, A., et al. Integrin beta3 regulates clonality and fate of smooth muscle-derived atherosclerotic plaque cells. Nature Communications. 9 (1), 2073 (2018).
- Majesky, M. W., et al. Differentiated Smooth Muscle Cells Generate a Subpopulation of Resident Vascular Progenitor Cells in the Adventitia Regulated by Klf4. Circulation Research. 120 (2), 296-311 (2017).
- Herring, B. P., Hoggatt, A. M., Burlak, C., Offermanns, S. Previously differentiated medial vascular smooth muscle cells contribute to neointima formation following vascular injury. Vascular Cell. 6, 21 (2014).
- Sheikh, A. Q., Misra, A., Rosas, I. O., Adams, R. H., Greif, D. M. Smooth muscle cell progenitors are primed to muscularize in pulmonary hypertension. Science Translational Medicine. 7 (308), (2015).
- Bentzon, J. F., Majesky, M. W. Lineage tracking of origin and fate of smooth muscle cells in atherosclerosis. Cardiovascular Research. 114 (4), 492-500 (2018).
- Wirth, A., et al. G12-G13-LARG-mediated signaling in vascular smooth muscle is required for salt-induced hypertension. Nature Medicine. 14 (1), 64-68 (2008).
- Mattson, D. L. Comparison of arterial blood pressure in different strains of mice. American Journal of Hypertension. 14 (5), 405-408 (2001).
- Whitesall, S. E., Hoff, J. B., Vollmer, A. P., D’Alecy, L. G. Comparison of simultaneous measurement of mouse systolic arterial blood pressure by radiotelemetry and tail-cuff methods. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286 (6), 2408-2415 (2004).
- Durgin, B. G., et al. Smooth muscle cell-specific deletion of Col15a1 unexpectedly leads to impaired development of advanced atherosclerotic lesions. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 312 (5), 943-958 (2017).
- Durham, A. L., Speer, M. Y., Scatena, M., Giachelli, C. M., Shanahan, C. M. Role of smooth muscle cells in vascular calcification: implications in atherosclerosis and arterial stiffness. Cardiovascular Research. 114 (4), 590-600 (2018).
- Lin, M. E., et al. Runx2 Deletion in Smooth muscle Cells Inhibits Vascular Osteochondrogenesis and Calcification but not Atherosclerotic Lesion Formation. Cardiovascular Research. , (2016).
- Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving Bioscience Research Reporting: The ARRIVE Guidelines for Reporting Animal Research. PLoS Biology. 8 (6), 1000412 (2010).
- Landis, S. C., et al. A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research. Nature. 490 (7419), 187-191 (2012).
- Nishioka, T., et al. Contribution of inadequate compensatory enlargement to development of human coronary artery stenosis: An in vivo intravascular ultrasound study. Journal of the American College of Cardiology. 27 (7), 1571-1576 (1996).
- Pasterkamp, G., et al. Paradoxical Arterial-Wall Shrinkage May Contribute to Luminal Narrowing of Human Atherosclerotic Femoral Arteries. Circulation. 91 (5), 1444-1449 (1995).
- Galkina, E., et al. Lymphocyte recruitment into the aortic wall before and during development of atherosclerosis is partially L-selectin dependent. The Journal of Experimental Medicine. 203 (5), 1273-1282 (2006).
- Venegas-Pino, D. E., Banko, N., Khan, M. I., Shi, Y., Werstuck, G. H. Quantitative analysis and characterization of atherosclerotic lesions in the murine aortic sinus. Journal of Visual Experiments. (82), 50933 (2013).
