Analisi quantitativa della composizione cellulare nelle lesioni aterosclerotiche avanzate del muscolo liscio delle cellule Lineage-Tracing topi
Summary
Vi proponiamo un protocollo standardizzato per caratterizzare la composizione cellulare delle lesioni aterosclerotiche murine di stadio avanzato compreso di metodi sistematici di dissezione animale, inclusione di tessuti, taglio, colorazione e analisi delle arterie brachiocefaliche dai topi di atheroprone del muscolo liscio delle cellule lignaggio traccia.
Abstract
L’aterosclerosi rimane la principale causa di morte nel mondo e, nonostante innumerevoli studi preclinici che descrive promettenti bersagli terapeutici, nuovi interventi sono rimasti sfuggenti. Questo è probabilmente dovuta, in parte, a una dipendenza da modelli preclinici di prevenzione che studiano gli effetti delle manipolazioni genetiche o trattamenti farmacologici sullo sviluppo di aterosclerosi, piuttosto che di malattia stabilita. Anche, i risultati di questi studi sono spesso confusione perché l’uso delle analisi di lesione superficiale e una mancanza di caratterizzazione delle popolazioni di cellule di lesione. Per aiutare a superare questi ostacoli traslazionali, proponiamo un maggiore affidamento su modelli di intervento che impiegano indagine dei cambiamenti nella composizione cellulare a livello di singola cellula di macchiatura di immunofluorescenza e microscopia confocale. A tal fine, descriviamo un protocollo per la prova di un presunto agente terapeutico in un modello murino di intervento compreso un approccio sistematico per la dissezione animale, l’incorporamento, sezionamento, colorazione e quantificazione delle lesioni dell’arteria brachiocefalica. Inoltre, a causa della diversità fenotipica delle cellule all’interno delle lesioni aterosclerotiche ritardo-fase, descriviamo l’importanza di utilizzare sistemi di cellula-specifico, inducibile lignaggio traccia mouse e come questo può essere sfruttato per caratterizzazione imparziale delle popolazioni di cellule della lesione aterosclerotica. Insieme, queste strategie possono assistere i biologi vascolari più accuratamente gli interventi terapeutici di modellare ed analizzare la malattia aterosclerotica e speriamo che si tradurranno in un più alto tasso di successo negli studi clinici.
Introduction
L’aterosclerosi è la principale causa di morbilità e mortalità in tutto il mondo sottostante la maggior parte di malattia dell’arteria coronaria, malattie delle arterie periferiche e di colpo. Ritardo-fase aterosclerosi coronaria può portare a complicazioni gravi tra cui contabilità l’infrazione del miocardio quasi il 16% del mondo popolazione mortalità1,2. A causa di un impatto devastante sulla salute pubblica, notevoli sforzi compiuti per decifrare i meccanismi che guidano la progressione di aterosclerosi, così come per sviluppare nuove strategie terapeutiche. Ancora, il tasso di probabilità di approvazione (LOA) di studi clinici per la malattia cardiovascolare è tra i più bassi se paragonato con altri campi clinici (solo 8,7% per la fase I)3. Ciò può essere spiegato in parte da molte barriere che l’aterosclerosi rappresenta per lo sviluppo di farmaci efficaci tra cui la sua natura quasi onnipresente, progressione clinicamente silenziosa e malattia significativa eterogeneità. Inoltre, il design non ottimale di alcuni studi preclinici possa essere rappresentato anche la mancanza di successo nella traduzione clinica. In particolare, riteniamo che è necessario implementare gli studi di intervento ove possibile, per studiare l’efficacia di strategie terapeutiche. Inoltre, c’è una necessità critica di eseguire le procedure standardizzate per le analisi di lesione compreso caratterizzazione avanzata di composizione cellulare lesione aterosclerotica ritardo-fase phenotyping e la mappatura di destino.
La stragrande maggioranza degli studi aterosclerosi concentrarsi su modelli di prevenzione di aterosclerosi composto da droga trattamento o gene manipolazione (KO o knock-in) in topi giovani sani, prima dell’inizio di malattia e progressione. Questi studi hanno portato alla luce un gran numero di geni e molecole di segnalazione che svolgono un ruolo nello sviluppo di aterosclerosi. Tuttavia, la maggior parte di queste destinazioni non è riuscito a tradurre alle terapie efficienti nell’essere umano. In effetti, è difficile estrapolare l’effetto di una terapia su topi sani giovani ai pazienti anziani con lesioni aterosclerotiche avanzate. Come tale, la realizzazione di studi di intervento in cantiere sperimentale preclinica probabile fornisce una rappresentazione più accurata della pertinenza e dell’efficacia di un nuovo terapeutico. L’idea è sostenuta dagli effetti straordinariamente divergenti di inibire le citochine proinfiammatorie interleuchina-1 β (IL-1 β) quando si impiegano una prevenzione4,5,6 o intervento strategia7. Differenze tra prevenzione e studi di intervento suggeriscono che diversi processi cellulari si verificano alle diverse fasi di sviluppo di aterosclerosi e sottolinea il fatto che studi di prevenzione sono probabilmente insufficiente per modellare lo scenario clinico adeguatamente.
L’American Heart Association ha recentemente pubblicato una dichiarazione scientifica dettagliare raccomandazioni per la corretta progettazione sperimentale, standardizzazione procedurale, analisi e reporting di aterosclerosi animale studi8. Evidenzia i vantaggi ei limiti di predominante tecniche utilizzate nel campo. Ad esempio, face it Sudan IV macchiatura dell’aorta viene spesso eseguita come una prima lettura. Anche se face it Sudan IV macchiatura del deposito del lipido è un metodo adatto per la valutazione del carico globale della placca, è in grado di distinguere le lesioni grasse della striscia iniziale da lesioni più avanzate di ritardo-fase. Come tale, l’interpretazione di face it colorazione è spesso ambigua e superficiale9. Un’attenta analisi del tessuto sezioni trasversali utilizzando la dimensione del vaso, lesione e lume di parametri morfologici e quantificazione degli indici di stabilità della lesione fornisce una comprensione più precisa dell’effetto di un esperimento.
Infine, l’istopatologia umana studi hanno suggerito che la composizione cellulare è un migliore preannunciatore della rottura che la dimensione della lesione stessa, con lesioni poveri nelle cellule muscolari lisce (SMC) e ricchi di macrofagi essere più suscettibili a rottura10, 11. Queste osservazioni sono state basate sulla macchiatura per marcatori classicamente utilizzati per l’identificazione delle cellule (cioè, ACTA2 per SMC e LGALS3 o CD68 per i macrofagi). Tuttavia, l’espressione di questi indicatori non è rigorosamente limitato a un singola cella tipo nelle lesioni aterosclerotiche dovuto la plasticità di stirpi multipli tra cui SMC, cellule endoteliali e cellule mieloidi12. In particolare, l’identificazione univoca degli SMC all’interno della lesione aterosclerotica era praticamente impossibile fino a quando nell’ultimo decennio a causa della proprietà di queste cellule a dedifferentiate e a reprimere i loro geni marcatori lineage-specifici di (un processo definito commutazione fenotipica) in vasi feriti o malati13. Questa limitazione nell’identificazione di SMC è stata aggirata tramite lo sviluppo di lignaggio traccia7,14,15,16,17,18, 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24. si compone di etichettatura permanentemente SMC e la loro progenie per tenere traccia di loro destino e l’evoluzione fenotipica durante la progressione di aterosclerosi utilizzando una combinazione dell’espressione di Cre ricombinasi guidato da promotori SMC-specifici (ad esempio, Myh117,15,17,18,19,20,21,22,23 , 24, Acta225,26 e, SM22α14,16) e l’attivazione dei reporter (ad es., proteine fluorescenti, β-galattosidasi) [recensione a Bentzon e Majesky 201827]. In uno dei primi studi che impiegano l’analisi del lignaggio SMC fuori regolazione embriogenesi, Speer et al.14 fornito la prova che SMC possano modulare il loro fenotipo e transdifferenziare nelle cellule chondrogenic durante la calcificazione vascolare utilizzando un modello di traccia SM22α Cre R26R LacZ lignaggio. Sebbene questi studi ha aperto la strada traccia del lignaggio SMC, erano parzialmente equivoci in quanto qualsiasi dato non-SMC esprimenti SM22α nella regolazione della malattia sarebbe essere etichettati dal reporter. Questa limitazione è stata ignorata dallo sviluppo e l’uso di tamoxifen-inducible Cre ERT/LoxP permettendo un controllo temporale della cella etichettatura. Etichettatura delle cellule si verifica esclusivamente durante la consegna di tamoxifene e sarà limitato alla cella esprimendo il promotore di tipo-specifico cellulare Guida espressione di Cre ERT al tempo di esposizione di tamoxifen, evitando l’analisi di tipi cellulari alternativi attivazione Cre nella impostazione della progressione di malattia. Per l’analisi di lignaggio di SMC nell’aterosclerosi, il tamoxifene-inducible Myh11– Cre/ERT2 transgene associato reporter fluorescenti (eYFP7,15,17,18 , 21, mTmG19,25, coriandoli20,22,23 per studi di espansione clonale) ha dimostrato una notevole efficienza e specificità in SMC etichettatura e ha stato utilizzato per le popolazioni di SMC mappa destino nelle lesioni aterosclerotiche in studi recenti. D’importanza, questi studi hanno rivelato che: 1) 80% di SMC interno avanzato di lesioni aterosclerotiche fare non esprimere qualsiasi convenzionali marcatori SMC (ACTA2, MYH11) utilizzati nell’analisi di immunohistological e pertanto sarebbe sono stati erroneamente senza traccia di lignaggio 17; 2) sottoinsiemi di SMC esprimono marcatori di tipi cellulari alternativi tra cui marcatori dei macrofagi o cellule staminali mesenchimali marcatori16,17,19; e 3) SMC investire e popola lesione aterosclerotica espansione di oligoclonal e SMC cloni conservano plasticità alla transizione a fenotipicamente diverse popolazioni20,23. Per riassumere, è ormai chiaro che le cellule muscolari lisce presentano una notevole diversità fenotipica in lesioni aterosclerotiche e possono avere ruoli benefici o dannosi sulla patogenesi della lesione a seconda della natura delle loro transizioni fenotipiche. Queste scoperte rappresentano una notevole nuova strada terapeutica per il targeting SMC athero-Promozione fenotipiche transizioni in ritardo-fase aterosclerosi.
Nel presente documento, vi proponiamo un protocollo standardizzato per l’analisi di fase avanzata lesioni aterosclerotiche murine inclusi metodi sistematici per la dissezione animale, l’incorporamento, sezionamento, colorazione e quantificazione delle lesioni dell’arteria brachiocefalica. Per determinare l’effetto di inibizione dell’interleuchina-1 β sul destino SMC e fenotipo, abbiamo usato il lignaggio SMC traccia ApoE– / – topi alimentati una dieta occidentale per 18 settimane prima di ricevere le iniezioni settimanali di un anticorpo anti-IL1β o pari isotipo IgG controllo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nonostante decenni di ricerca e progressi tecnici nello studio della aterosclerosi, il campo ha una storia deludente di tradurre le scoperte scientifiche a terapie cliniche34,35. Questo fenomeno può essere spiegato in parte dalle discrepanze in modelli animali, disegni sperimentali e analisi della lesione. Qui, descriviamo una pipeline sperimentale che abbiamo usato per analizzare la composizione cellulare in lesioni aterosclerotiche avanzate utilizzando lignagg…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il centro per l’Imaging biologico (supportato da NIH 1S10OD019973-01) presso l’Università di Pittsburgh per la loro assistenza. Questo lavoro è stato supportato da è supportato da Scientific Development Grant 15SDG25860021 dall’associazione americana del cuore di r.a.b. D.G. è stata sostenuta dal NIH concedere F30 HL136188.
Materials
| 16% Paraformaldehyde aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | RT 15710 | Tissue perfusion and fixation |
| 23G butterfly needle | Fisher | BD367342 | |
| 25G needle | Fisher | 14-821-13D | |
| A1 Confocal microscope | Nikon | Confocal microscope | |
| ACTA2-FITC antibody (mouse) | Sigma Aldrich | F3777 | Primary Antibody |
| Alexa-647 anti goat | Invitrogen | A-21447 | Secondary antibody |
| Antigen Unmasking solution, Citric acid based | Vector Labs | H-3300 | Antigen retrieval solution |
| Chow Diet | Harlan Teklad | TD.7012 | |
| Coverslip | Fisher | 12-544-14 | Any 50 x 24 mm cover glass |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | Nucleus fluorescent counterstaining |
| Donkey Alexa-488 anti-rabbit | Invitrogen | A-21206 | Secondary antibody |
| Donkey Alexa-555 anti-rat | Abcam | ab150154 | Secondary antibody |
| DPBS 10X without Calcium and Magnesium | Gibco | 14200166 | PBS for solution dilutions and washes. Dilute to 1x in deionized water |
| Embedding cassette | Fisher | 15-182-701D | |
| ETDA vacuum tube | Fisher | 02-685-2B | |
| Ethanol 200 proof | Decon | 2701 | |
| Foam pad | Fisher | 22-222-012 | |
| Gelatin from cold water fish skin | Sigma Aldrich | G7765 | |
| GFP antibody (goat) | abcam | ab6673 | Primary antibody |
| goat IgG control | Vector Labs | I-5000 | IgG control |
| High Fat Diet | Harlan Teklad | TD.88137 | |
| ImageJ | NIH | Computer program https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| LGALS3 antibody (rat) | Cedarlane | CL8942AP | Primary antibody |
| LSM700 confocal microscope | Zeiss | Confocal microscope | |
| Microscope Slides, Superfrost Plus | Fisher | 12-550-15 | |
| Microtome blades | Fisher | 30-538-35 | |
| Mouse IgG control | Vector Labs | I-2000 | IgG control |
| NIS element imaging software | Nikon | Imaging software for z-stack image acquisition | |
| Normal Horse serum | Sigma Aldrich | H1270 | |
| Pap Pen | Fisher | 50-550-221 | |
| Peanut oil | Sigma | P2144 | |
| Prolong gold Antifade mountant | Invitrogen | P36930 | Mounting medium |
| Rabbit IgG control | Vector Labs | I-1000 | IgG control |
| Rat IgG control | Vector Labs | I-4000 | IgG control |
| RUNX2 antibody (rabbit) | Abcam | ab192256 | Primary Antibody |
| Syringe | BD | 309628 | 1 ml syringe |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| Xylene | Fisher | X55K-4 | |
| Zen imaging software | Zeiss | Imaging software for z-stack image acquisition |
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