Kantitatif analiz düz kas hücre soy izleme farelerin gelişmiş aterosklerotik lezyonları içinde hücresel kompozisyon
Summary
Biz hayvan diseksiyon, doku gömme, kesit, Boyama, ve brachiocephalic arterler analizini sistematik yöntemleri de dahil olmak üzere son aşama fare aterosklerotik lezyonları hücresel bileşimi karakterize etmek için standart bir protokol öneriyoruz atheroprone düz kas hücre soy izleme fare.
Abstract
Ateroskleroz ölüm dünya çapında önde gelen nedenidir kalır ve umut verici tedavi hedeflerini açıklayan sayısız preklinik çalışmalar rağmen roman müdahaleler zor kalmıştır. Bu nedeniyle, kısmen, bir güven kurulan hastalık yerine genetik manipülasyon veya farmakolojik tedaviler ateroskleroz gelişimi üzerine etkilerini araştıran preklinik önleme modelleri için muhtemeldir. Ayrıca, bu çalışmaların sonuçları yüzeysel lezyon analizleri kullanımı ve lezyon hücre popülasyonlarının karakterizasyonu olmaması nedeniyle karıştırıcı çoğu kez. Bu çevirim engellerin üstesinden yardımcı olmak için bir tek hücre düzeyinde hücresel bileşiminde değişiklikler incelenmesi immünfloresan boyama ve confocal mikroskobu tarafından istihdam müdahale modelleri üzerinde artan bir güven öneriyorum. Bu amaçla, biz sözde bir terapötik Ajan hayvan diseksiyon, gömme, kesit, boyama ve brachiocephalic damar tutulumu miktar için sistematik bir yaklaşım da dahil olmak üzere bir fare müdahale modeli test etmek için bir protokol tanımlamak. Ayrıca, son aşama aterosklerotik lezyonları hücrelerde fenotipik çeşitliliği nedeniyle, hücre özgü, indüklenebilir soy izleme fare sistemleri ve nasıl bu tarafsız karakterizasyonu için kullanılacak olabilir kullanmanın önemini açıklamaktadır Aterosklerotik Lezyonu hücre popülasyonlarının. Birlikte, bu stratejileri daha doğru bir şekilde tedavi müdahaleler modellemek ve aterosklerotik hastalık çözümlemek için vasküler biyologlar yardımcı olabilir ve umut verici bir biçimde klinik başarı daha yüksek oranda içine çevirmek olacaktır.
Introduction
Ateroskleroz morbidite ve mortalite dünya çapında koroner arter hastalığı, periferik arter hastalıkları ve felç çoğunluğu temel önde gelen nedenidir. Son aşama koroner ateroskleroz miyokardiyal bozma muhasebe Dünya nüfus ölüm1,2yaklaşık % 16 gibi ciddi komplikasyonlara yol açabilir. Halk sağlığı üzerindeki yıkıcı etkisi nedeniyle, önemli çaba ateroskleroz ilerleme roman tedavi stratejileri geliştirmek için sürüş mekanizmaları deşifre etmek için yapılmış. Henüz, onay olasılığını (LOA) klinik kardiyovasküler hastalık için en düşük arasında sadece ben (%8,7 için faz) klinik diğer alanları ile karşılaştırıldığında3oranıdır. Bu açıklanabilir kısmen birçok engellerin tarafından o ateroskleroz, neredeyse her yerde doğa, klinik olarak sessiz ilerleme ve önemli hastalık heterojenite dahil olmak üzere etkili ilaç geliştirme için poz veriyor. Ayrıca, preklinik hayvan çalışmaları suboptimal tasarımını da klinik çeviri başarı eksikliği oluşturuyor. Özellikle, müdahale çalışmaları mümkün olduğunda tedavi stratejileri etkinliğini araştırmak uygulamak için gerekli olduğunu düşünüyoruz. Ayrıca, son aşama Aterosklerotik Lezyonu hücresel kompozisyon gelişmiş karakterizasyonu kader haritalama ve fenotipleme tarafından da dahil olmak üzere lezyon analizleri için standart yordamları gerçekleştirmek için kritik bir ihtiyaç vardır.
Ateroskleroz çalışmaları büyük çoğunluğu uyuşturucu tedavi veya gen manipülasyon (nakavt veya çakma) hastalık başlama ve ilerleme önce sağlıklı genç farelerde oluşan ateroskleroz önleme modellerinin odaklanmak. Bu çalışmalar, genler ve ateroskleroz gelişmede rol sinyal molekülleri çok sayıda ortaya çıkardı. Ancak, bu hedeflerin çoğunu insan etkili tedaviler için çevirmek başarısız oldu. Gerçekten de, bir terapi gelişmiş aterosklerotik lezyonları olan yaşlı hastalar için sağlıklı genç fareler üzerinde etkisini tahmin etmek zordur. Bu nedenle, müdahale çalışmaları preklinik deneysel boru hattı büyük olasılıkla uygulanması alaka düzeyini ve etkinliğinin yeni bir tedavi daha doğru bir tasviri sağlar. Fikri bir önleme4,5,6 veya müdahale stratejisi7istihdam pro-inflamatuar sitokin İnterlökin-1β (IL-1β) inhibe çarpıcı farklı etkileri tarafından desteklenir. Önleme ve müdahale çalışmaları arasındaki farklar öneririz farklı hücresel süreçler farklı ateroskleroz geliştirme aşamalarında ortaya ve önleme çalışmaları muhtemel olduğu gerçeği vurgulamaktadır yetersiz klinik senaryo modellemek yeterli.
Amerikan Kalp Derneği son zamanlarda uygun deneysel tasarım, yordam standardizasyon, analiz ve hayvan ateroskleroz çalışmalar8/ raporlama için öneriler ayrıntılı bilimsel bir açıklama yayınladı. Faydaları ve kısıtlamaları baskın teknikleri alanında kullanılan vurgulamaktadır. Örneğin, aorta Sudan IV tr yüz boyama genellikle ilk okuma gerçekleştirilir. Lipid birikimi Sudan IV tr yüz boyama küresel plak yükünün değerlendirmesi için uygun bir yöntem olsa da, daha gelişmiş son aşama lezyon aşamasındaki yağlı çizgi lezyonlar ayırt edemiyor. Bu nedenle, tr yüz boyama yorumu kez belirsiz ve yüzeysel9‘ dur. Dikkatli analiz dokusunun kesitleri Miktar Endeksi lezyon istikrar ve morfolojik parametreleri gemi, lezyon ve Lümen boyutu kullanarak bir deneme etkisini daha doğru bir anlayış sağlar.
Son olarak, insan histopatoloji çalışmalarda hücresel kompozisyon rüptürü daha iyi bir tahmin boyutundan lezyon kendisi, düz kas hücreleri (SMC) içinde lezyonlar yoksul ve makrofajlar10rüptürü daha duyarlı olmak zengin olduğunu düşündürmektedir, 11. Bu gözlemler klasik hücre kimliği için kullanılan işaretleri boyama dayalı idi (yani, SMC ve LGALS3 veya CD68 makrofajlar için ACTA2). Ancak, bu işaretleri ifade kesinlikle tek hücre türü için birden fazla soy SMC, endotel hücreleri ve myeloid hücrelerin12gibi plastisite nedeniyle aterosklerotik lezyonları içinde sınırlı değildir. Özellikle, SMC benzersiz tanımlaması Aterosklerotik Lezyonu içinde son on yıl kadar dedifferentiate ve soy özgü marker genleri (bir süreç denir bastırmak için bu hücre özelliği nedeniyle neredeyse imkansız fenotipik anahtarlama) yaralı ya da hastalıklı gemiler13‘ te. Bu sınırlama SMC tanımlama soy izleme7,14,15,16,17,18, geliştirme tarafından hile 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24. o oluşmak-in kalıcı olarak etiketleme SMC ve onların döl onların kaderi ve fenotipik evrim ateroskleroz ilerleme sırasında SMC özel rehberleri tarafından tahrik Cre recombinase ifade kullanarak izlemek için (yani, Myh117,15,17,18,19,20,21,22,23 , 24, Acta225,26 ve, SM22α14,16) ve [Bentzon ve Majesky gözden gazetecilere (örn, floresan proteinler, β-galaktozidaz) harekete geçirmek 201827]. Bir SMC soy izleme embriyogenez ayarı dışında istihdam ilk çalışmalar, SMC onların fenotip ve transdifferentiate chondrogenic hücrelere sırasında Vasküler kalsifikasyon kullanarak modüle ki kanıt Speer vd.14 sağlanan bir SM22α Cre R26R LacZ soy izleme modeli. Bu çalışmalar SMC soy izleme öncülük rağmen herhangi bir belirli olmayan SMC ifade SM22α hastalığın ortamda tarafından muhabir olarak etiketlenmiş olacak ki onlar kısmen belirsiz vardı. Bu sınırlama geliştirme ve kullanımı, Tamoksifen indüklenebilir Cre ERT/hücre etiketleme zamansal bir denetim erişimine izin verme LoxP tarafından baypas edilmiş. Sadece tamoxifen teslim sırasında oluşur ve izleme Cre içinde etkinleştirme alternatif hücre tiplerinin kaçınarak Cre ERT ifade tamoxifen pozlama, zaman sürüş hücre türüne özgü organizatörü ifade hücre sınırlı hücre etiketleme hastalığın ilerlemesini ayarlama. SMC ateroskleroz, floresan gazetecilere (eYFP7,15,17,18 ile ilişkili tamoxifen indüklenebilir Myh11– Cre/ERT2 transgene içinde soy izleme için , 21, mTmG19,25, klonal genişletme çalışmaları için konfeti20,22,23 ) olağanüstü verimliliği ve özgüllük SMC etiketleme göstermiştir ve vardır Kader harita SMC nüfus son yıllarda yapılan çalışmalarda aterosklerotik lezyonları için kullanılmıştır. Önemlisi, bu çalışmalar bu açığa: 1) SMC % 80’i içinde aterosklerotik lezyonları yapmak gelişmiş değil ifade immunohistological analizinde kullanılan herhangi bir geleneksel SMC işaretleri (ACTA2, MYH11) ve bu nedenle soy izleme olmadan tanımlanmış 17; 2) SMC kümelerine işaretleri makrofaj işaretleri veya Mezenkimal Kök hücre işaretleri16,17,19da dahil olmak üzere diğer hücre tiplerinin hızlı; ve 3) SMC yatırım ve Aterosklerotik Lezyonu oligokonal genişleme doldurmak ve SMC klonlar korumak plastisite geçiş phenotypically farklı popülasyonlar20,23. Özetlemek gerekirse, bunu şimdi düz kas hücreleri bir dikkat çekici fenotipik çeşitlilik aterosklerotik lezyonlarının sunmak ve faydalı veya zararlı rol lezyon Patogenez onların fenotipik geçişler niteliğine bağlı olarak üzerinde olabilir açıktır. Bu keşifler SMC athero teşvik fenotipik geçişler son aşama ateroskleroz hedefleme için dikkate değer yeni bir tedavi cadde temsil eder.
Burada, biz hayvan diseksiyon, gömme, kesit, boyama ve brachiocephalic damar tutulumu miktar için sistematik yöntemleri de dahil olmak üzere son aşama fare aterosklerotik lezyonları analiz etmek için standart bir protokol öneriyoruz. İnterlökin-1β inhibisyon SMC kader ve fenotip üzerindeki etkisini belirlemek için SMC lineage ApoE– / – fareler bir anti-IL1β antikor veya IgG izotip eşlemeli denetimin haftalık enjeksiyonları almadan önce 18 hafta boyunca Batı diyet beslenen izleme kullanılır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Onlarca yıllık araştırma ve ateroskleroz eğitim teknik gelişmeler rağmen alan klinik tedaviler34,35bilimsel bulgular çeviri hayal kırıklığı bir geçmişi vardır. Bu olay kısmen hayvan modelleri, Deneysel Tasarımlar ve lezyon analizleri tutarsızlıklar tarafından açıklanabilir. Burada, soy izleme fareler7kullanarak gelişmiş aterosklerotik lezyonları hücresel bileşiminde çözümlemek için kullanılan deneysel bir b…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz Merkezi biyolojik (NIH 1S10OD019973-01 tarafından desteklenen) görüntüleme için Pittsburgh Üniversitesi onların yardım için teşekkür ederim. Bu eser desteklenmiştir bilimsel kalkınma hibe D.G. R.A.B. için Amerikan Kalp Derneği’nden 15SDG25860021 tarafından desteklenen tarafından desteklenmektedir NIH F30 HL136188 verin.
Materials
| 16% Paraformaldehyde aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | RT 15710 | Tissue perfusion and fixation |
| 23G butterfly needle | Fisher | BD367342 | |
| 25G needle | Fisher | 14-821-13D | |
| A1 Confocal microscope | Nikon | Confocal microscope | |
| ACTA2-FITC antibody (mouse) | Sigma Aldrich | F3777 | Primary Antibody |
| Alexa-647 anti goat | Invitrogen | A-21447 | Secondary antibody |
| Antigen Unmasking solution, Citric acid based | Vector Labs | H-3300 | Antigen retrieval solution |
| Chow Diet | Harlan Teklad | TD.7012 | |
| Coverslip | Fisher | 12-544-14 | Any 50 x 24 mm cover glass |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | Nucleus fluorescent counterstaining |
| Donkey Alexa-488 anti-rabbit | Invitrogen | A-21206 | Secondary antibody |
| Donkey Alexa-555 anti-rat | Abcam | ab150154 | Secondary antibody |
| DPBS 10X without Calcium and Magnesium | Gibco | 14200166 | PBS for solution dilutions and washes. Dilute to 1x in deionized water |
| Embedding cassette | Fisher | 15-182-701D | |
| ETDA vacuum tube | Fisher | 02-685-2B | |
| Ethanol 200 proof | Decon | 2701 | |
| Foam pad | Fisher | 22-222-012 | |
| Gelatin from cold water fish skin | Sigma Aldrich | G7765 | |
| GFP antibody (goat) | abcam | ab6673 | Primary antibody |
| goat IgG control | Vector Labs | I-5000 | IgG control |
| High Fat Diet | Harlan Teklad | TD.88137 | |
| ImageJ | NIH | Computer program https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| LGALS3 antibody (rat) | Cedarlane | CL8942AP | Primary antibody |
| LSM700 confocal microscope | Zeiss | Confocal microscope | |
| Microscope Slides, Superfrost Plus | Fisher | 12-550-15 | |
| Microtome blades | Fisher | 30-538-35 | |
| Mouse IgG control | Vector Labs | I-2000 | IgG control |
| NIS element imaging software | Nikon | Imaging software for z-stack image acquisition | |
| Normal Horse serum | Sigma Aldrich | H1270 | |
| Pap Pen | Fisher | 50-550-221 | |
| Peanut oil | Sigma | P2144 | |
| Prolong gold Antifade mountant | Invitrogen | P36930 | Mounting medium |
| Rabbit IgG control | Vector Labs | I-1000 | IgG control |
| Rat IgG control | Vector Labs | I-4000 | IgG control |
| RUNX2 antibody (rabbit) | Abcam | ab192256 | Primary Antibody |
| Syringe | BD | 309628 | 1 ml syringe |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| Xylene | Fisher | X55K-4 | |
| Zen imaging software | Zeiss | Imaging software for z-stack image acquisition |
References
- GBD DALYs and HALE Collaborators. Global, regional, and national disability-adjusted life-years (DALYs) for 315 diseases and injuries and healthy life expectancy (HALE), 1990-2015: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2015. Lancet. 388 (10053), 1603-1658 (2016).
- Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2018 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 137 (12), 67-92 (2018).
- Hay, M., Thomas, D. W., Craighead, J. L., Economides, C., Rosenthal, J. Clinical development success rates for investigational drugs. Nature Biotechnology. 32 (1), 40-51 (2014).
- Bhaskar, V., et al. Monoclonal antibodies targeting IL-1 beta reduce biomarkers of atherosclerosis in vitro and inhibit atherosclerotic plaque formation in Apolipoprotein E-deficient mice. Atherosclerosis. 216 (2), 313-320 (2011).
- Isoda, K., et al. Lack of interleukin-1 receptor antagonist modulates plaque composition in apolipoprotein E-deficient mice. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 24 (6), 1068-1073 (2004).
- Kirii, H., et al. Lack of interleukin-1beta decreases the severity of atherosclerosis in ApoE-deficient mice. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 23 (4), 656-660 (2003).
- Gomez, D., et al. Interleukin-1β has atheroprotective effects in advanced atherosclerotic lesions of mice. Nature Medicine. 24, 1418-1429 (2018).
- Daugherty, A., et al. Recommendation on Design, Execution, and Reporting of Animal Atherosclerosis Studies: A Scientific Statement From the American Heart Association. Circulation Research. 121 (6), 53-79 (2017).
- Baylis, R. A., Gomez, D., Owens, G. K. Shifting the Focus of Preclinical, Murine Atherosclerosis Studies From Prevention to Late-Stage Intervention. Circulation Research. 120 (5), 775-777 (2017).
- Kolodgie, F. D., et al. Pathologic assessment of the vulnerable human coronary plaque. Heart. 90 (12), 1385-1391 (2004).
- Virmani, R., Kolodgie, F. D., Burke, A. P., Farb, A., Schwartz, S. M. Lessons from sudden coronary death: a comprehensive morphological classification scheme for atherosclerotic lesions. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 20 (5), 1262-1275 (2000).
- Gomez, D., Owens, G. K. Smooth muscle cell phenotypic switching in atherosclerosis. Cardiovascular Research. 95 (2), 156-164 (2012).
- Owens, G. K., Kumar, M. S., Wamhoff, B. R. Molecular regulation of vascular smooth muscle cell differentiation in development and disease. Physiological Reviews. 84 (3), 767-801 (2004).
- Speer, M. Y., et al. Smooth muscle cells give rise to osteochondrogenic precursors and chondrocytes in calcifying arteries. Circulation Research. 104 (6), 733-741 (2009).
- Gomez, D., Shankman, L. S., Nguyen, A. T., Owens, G. K. Detection of histone modifications at specific gene loci in single cells in histological sections. Nature Methods. 10 (2), 171-177 (2013).
- Feil, S., et al. Transdifferentiation of vascular smooth muscle cells to macrophage-like cells during atherogenesis. Circulation Research. 115 (7), 662-667 (2014).
- Shankman, L. S., et al. KLF4-dependent phenotypic modulation of smooth muscle cells has a key role in atherosclerotic plaque pathogenesis. Nature Medicine. 21, 628 (2015).
- Cherepanova, O. A., et al. Activation of the pluripotency factor OCT4 in smooth muscle cells is atheroprotective. Nature Medicine. 22, 657 (2016).
- Albarran-Juarez, J., Kaur, H., Grimm, M., Offermanns, S., Wettschureck, N. Lineage tracing of cells involved in atherosclerosis. Atherosclerosis. 251, 445-453 (2016).
- Chappell, J., et al. Extensive Proliferation of a Subset of Differentiated, yet Plastic, Medial Vascular Smooth Muscle Cells Contributes to Neointimal Formation in Mouse Injury and Atherosclerosis Models. Circulation Research. 119 (12), 1313-1323 (2016).
- Newman, A. A., et al. Irradiation abolishes smooth muscle investment into vascular lesions in specific vascular beds. JCI Insight. 3 (15), (2018).
- Dobnikar, L., et al. Disease-relevant transcriptional signatures identified in individual smooth muscle cells from healthy mouse vessels. Nature Communications. 9 (1), 4567 (2018).
- Misra, A., et al. Integrin beta3 regulates clonality and fate of smooth muscle-derived atherosclerotic plaque cells. Nature Communications. 9 (1), 2073 (2018).
- Majesky, M. W., et al. Differentiated Smooth Muscle Cells Generate a Subpopulation of Resident Vascular Progenitor Cells in the Adventitia Regulated by Klf4. Circulation Research. 120 (2), 296-311 (2017).
- Herring, B. P., Hoggatt, A. M., Burlak, C., Offermanns, S. Previously differentiated medial vascular smooth muscle cells contribute to neointima formation following vascular injury. Vascular Cell. 6, 21 (2014).
- Sheikh, A. Q., Misra, A., Rosas, I. O., Adams, R. H., Greif, D. M. Smooth muscle cell progenitors are primed to muscularize in pulmonary hypertension. Science Translational Medicine. 7 (308), (2015).
- Bentzon, J. F., Majesky, M. W. Lineage tracking of origin and fate of smooth muscle cells in atherosclerosis. Cardiovascular Research. 114 (4), 492-500 (2018).
- Wirth, A., et al. G12-G13-LARG-mediated signaling in vascular smooth muscle is required for salt-induced hypertension. Nature Medicine. 14 (1), 64-68 (2008).
- Mattson, D. L. Comparison of arterial blood pressure in different strains of mice. American Journal of Hypertension. 14 (5), 405-408 (2001).
- Whitesall, S. E., Hoff, J. B., Vollmer, A. P., D’Alecy, L. G. Comparison of simultaneous measurement of mouse systolic arterial blood pressure by radiotelemetry and tail-cuff methods. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286 (6), 2408-2415 (2004).
- Durgin, B. G., et al. Smooth muscle cell-specific deletion of Col15a1 unexpectedly leads to impaired development of advanced atherosclerotic lesions. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 312 (5), 943-958 (2017).
- Durham, A. L., Speer, M. Y., Scatena, M., Giachelli, C. M., Shanahan, C. M. Role of smooth muscle cells in vascular calcification: implications in atherosclerosis and arterial stiffness. Cardiovascular Research. 114 (4), 590-600 (2018).
- Lin, M. E., et al. Runx2 Deletion in Smooth muscle Cells Inhibits Vascular Osteochondrogenesis and Calcification but not Atherosclerotic Lesion Formation. Cardiovascular Research. , (2016).
- Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving Bioscience Research Reporting: The ARRIVE Guidelines for Reporting Animal Research. PLoS Biology. 8 (6), 1000412 (2010).
- Landis, S. C., et al. A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research. Nature. 490 (7419), 187-191 (2012).
- Nishioka, T., et al. Contribution of inadequate compensatory enlargement to development of human coronary artery stenosis: An in vivo intravascular ultrasound study. Journal of the American College of Cardiology. 27 (7), 1571-1576 (1996).
- Pasterkamp, G., et al. Paradoxical Arterial-Wall Shrinkage May Contribute to Luminal Narrowing of Human Atherosclerotic Femoral Arteries. Circulation. 91 (5), 1444-1449 (1995).
- Galkina, E., et al. Lymphocyte recruitment into the aortic wall before and during development of atherosclerosis is partially L-selectin dependent. The Journal of Experimental Medicine. 203 (5), 1273-1282 (2006).
- Venegas-Pino, D. E., Banko, N., Khan, M. I., Shi, Y., Werstuck, G. H. Quantitative analysis and characterization of atherosclerotic lesions in the murine aortic sinus. Journal of Visual Experiments. (82), 50933 (2013).
