Dissektion der lokalen Ca^{2 +} Signale in kultivierten Zellen durch die Membran-gezielte Ca^{2 +} Indikatoren

Summary

Hier präsentieren wir ein Protokoll für Ca^{2 +} Bildgebung in Neuronen und Gliazellen, die das Sezieren von Ca^{2 +} Signale in subzellulären Auflösung ermöglicht. Dieser Prozess gilt für alle Zelltypen, die die Expression von genetisch codierte Ca^{2 +} Indikatoren zu ermöglichen.

Abstract

Calcium-Ion (Ca^{2 +}) ist eine universelle intrazelluläre Messenger-Molekül, das mehrere Signalwege, führt zu vielfältigen biologischen Ausgänge treibt. Die Koordination der beiden Ca^{2 +} Signalquellen – "Ca^{2 +} Zustrom" von außerhalb der Zelle und "Ca^{2 +} Release" von der intrazellulären Ca2 + speichern endoplasmatische Retikulum (ER) – gilt die vielfältigen räumlich-zeitliche Muster von Ca zugrunde liegen ^{2 +} Signale, die mehrere biologische Funktionen in Zellen verursachen. Dieses Protokoll soll ein Ca^{2 +} bildgebendes Verfahren zu beschreiben, das ermöglicht die Überwachung der Augenblick der "Ca^{2 +} Zustrom" und "Ca^{2 +} release". OER-GCaMP6f ist ein genetisch codierte Ca^{2 +} Indikator (GECI) bestehend aus GCaMP6f, die auf der äußeren Membran ER ausgerichtet ist. OER-GCaMP6f kann Ca^{2 +} Version auf eine höhere zeitliche Auflösung als herkömmliche GCaMP6f überwachen. In Kombination mit der Plasmamembran ausgerichtete GECIs, kann die räumlich-zeitliche Ca^{2 +} Signalmuster mit einer subzellulären Auflösung beschrieben werden. Die subzelluläre gezielt Ca^{2 +} Indikatoren hier beschrieben sind, im Prinzip für alle Zelltypen, auch für die in-vivo von Caenorhabditis Elegans Neuronen imaging. In diesem Protokoll wir Ca^{2 +} Bildgebung in Zellen von Zelllinien, Neuronen und Gliazellen bei dissoziierten Primärkulturen einzuführen, und die Vorbereitung der gefrorenen Bestand an Ratte kortikale Neuronen beschreiben.

Introduction

Ca^{2 +} Signale stellen die Höhe der intrazellulären Ca^{2 +} Konzentration. Ca^{2 +} ist die universelle zweiten Messenger für eukaryotische Zellen. Mit Ca^{2 +}, Zellen funktionieren über verschiedene intrazelluläre Signalwege und verschiedenen biologischen Ausgänge zu induzieren. Z. B. in Neuronen, synaptischen Vesikel Release am präsynaptischen Terminal Genexpression in den Zellkern und Induktion der synaptischen Plastizität an der Postsynapse unterstehen verschiedene Ca^{2 +} Signale, die genau den entsprechenden aktivieren nachgeschalteter Enzyme an den richtigen Standorten und mit präzisem Timing¹.

Spezifischen räumlich-zeitliche Muster Ca^{2 +} Signale aktivieren die spezifischen nachgeschalteter Enzyme. Ca^{2 +} -Signale werden generiert, indem die Koordination zwischen zwei verschiedenen Ca^{2 +} Quellen: Ca^{2 +} Zustrom aus dem Extrazellulärraum und Ca^{2 +} Entlassung aus dem endoplasmatischen Retikulum (ER), dient als eine intrazelluläre Ca^{2 +} speichern. Die sinnvolle raumzeitliche Ca^{2 +} Signalisierung Muster induzieren eine bestimmte Zelle-Funktion wird auch durch Nanodomains von 10-100 µM Ca^{2 +} erzeugt in der Nähe von Ca^{2 +} -Kanäle in der Plasmamembran oder ER-Membran-²unterstützt. Wichtig ist, ist die Quelle von Ca^{2 +} Signale eines der wichtigsten Faktoren, die die nachgeschaltete biologischen Ausgabe. In Neuronen haben Ca^{2 +} Zustrom und Ca^{2 +} Release entgegengesetzte Effekte auf das clustering von Gamma - Aminobuttersäure (GABA)_A -Rezeptoren (GABA-_AR) an den GABAergen Synapsen, der verantwortlich für die Hemmung der neuronale Erregbarkeit³. Ca^{2 +} Zustrom begleitet von massiven neuronale Erregung induziert die Streuung der synaptischen GABA_AR Cluster, während anhaltende Ca^{2 +} Entlassung aus der Notaufnahme fördert das clustering von synaptischer GABA-_A-Rs. Andere Gruppen haben auch berichtet, dass Tune Richtung Wachstum Kegel Ca^{2 +} Signalquelle kritisch abhängig ist: Ca^{2 +} Zustrom induziert Abstoßung, während Ca^{2 +} Release die Attraktion für das neuronale Wachstum führt Kegel⁴. Daher, um die Ca^{2 +} Signalwege zugrunde liegenden spezifischen zellulären Ausgänge zu verstehen, ist es wichtig zur Identifizierung der Quelle von Ca^{2 +} Signale von Ca^{2 +} Signale in der subzellulären Auflösung zu beschreiben.

In diesem Protokoll beschreiben wir eine Ca^{2 +} bildgebende Methode um Ca^{2 +} Signale in der subzellulären Auflösung ermöglicht die Abschätzung der Ca^{2 +} Signalquellen (Abbildung 1) zu melden. Ca^{2 +} Microdomains unterhalb der Plasmamembran werden erfolgreich von genetisch codierte Ca^{2 +} Indikatoren (GECIs) gezielt an die Plasmamembran über die Befestigung der Plasmamembran-Lokalisierung Signal Lck in Src überwacht. Kinase N-Termini GECIs⁵. Um das Ca^{2 +} Signalmuster in der Nähe der ER auf eine bessere räumliche und zeitliche Auflösung erkennen, entwickelten wir vor kurzem OER-GCaMP6f, welche GCaMP6f⁶ Ziele der ER äußere Membran, mit der ER transmembranen Protein. OER-GCaMP6f kann sensibel Ca^{2 +} Entlassung aus der Notaufnahme mit einer besser räumlich-zeitliche Auflösung als herkömmliche nontargeted GCaMP6f COS-7 Zellen⁷ und HEK293 Zellen⁸, durch die Vermeidung der Verbreitung von Ca^{2 +} und GECIs melden. . Wir auch bestätigt, dass die spontane Ca^{2 +} Erhebung im kultivierten hippocampal Astrozyten berichtet von OER-GCaMP6f ein anderes räumlich-zeitliche Muster zeigte im Vergleich zu jener von Plasmamembran ausgerichtete GCaMP6f überwacht (Lck-GCaMP6f)^{7 ,9}, darauf hinweist, dass Ca^{2 +} Bildgebung mit OER-GCaMP6f in Kombination mit Lck-GCaMP6f, das Sezieren von Ca^{2 +} Signale in der subzellulären Auflösung trägt, ihre Quellen zu identifizieren.

Derzeit zeigen wir das Protokoll für die Ca^{2 +} Signal Dissektion im HeLa-Zellen und Neuron-Astrozyten Mischkulturen auf Glasdeckgläser überzogen. Die Ca^{2 +} bildgebende Verfahren mit GECIs angegeben hier Lck-GCaMP6f, Plasma-Membran-bezogenen RCaMP2¹⁰ (Lck-RCaMP2) und OER-GCaMP6f (Abbildung 1) gelten für alle Zellen, in denen diese GECIs ausgedrückt werden können.

Protocol

Alle hier beschriebenen Experimente wurden von RIKEN Sicherheitsausschuss und Tierversuch Ausschuss gemäß der Richtlinie ausgestellt vom japanischen Ministerium für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie genehmigt.

1. Vorbereitung der Zellen

1. Vorbereitung von Poly (Ethylenimin)-beschichtet Deckgläsern
   Hinweis: Poly(ethyleneimine) (PEI) Beschichtung ist für Glasapparaturen, empfohlen, da dadurch Neuronen und Astrozyten der Deckgläsern fest zuordnen, ohne ihre Entwicklung zu verhindern. Jedoch anderen Beschichtungsverfahren (z.B. Poly-Ornithin, L-Lysin, Laminin Beschichtung Poly) zur Verfügung stehen, falls erforderlich, für Glasboden Gerichte.
   1. Legen Sie einen Durchmesser von 18 mm Glas Deckglas in jede Vertiefung eine 12-Well-Platte. Ansetzen Sie 0,04 % PEI Lösung (12,5 mL/12-Well-Platte) mit sterilisierten Wasser.
   2. Fügen Sie 1 mL 0,04 % PEI Lösung in jede Vertiefung. Sicherzustellen Sie, dass es keine Luftblasen unter der Deckgläsern.
   3. Inkubieren Sie die Platten in einem CO₂ Inkubator über Nacht bei 37 ° c
   4. Am nächsten Tag Waschen der beschichteten Deckgläsern 3 X mit 1 mL Wasser sterilisiert. Entfernen Sie die PEI-Lösung mit einer Absauganlage, fügen Sie 1 mL sterilisierten Wasser in jede Vertiefung und schütteln Sie 12-Well-Platte zu, so dass die PEI-Lösung zwischen dem Deckglas und der Platte gründlich ausgewaschen werden. Wie die übrigen PEI giftig für Zellen ist, sicherstellen Sie, dass das Wasser nach das letzten Waschen komplett abgesaugt wird.
   5. Trocknen und Sterilisieren der Deckgläsern im Inneren der Haube mit Ultraviolett (UV) Licht für mindestens 15 Minuten. Die PEI-beschichtete Schale kann bis zu 2 Monate bei 4 ° C aufbewahrt werden. Beleuchten Sie die Gerichte mit UV-Licht für 15 min kurz vor Gebrauch.
   6. Fügen Sie 5 mL sterilem destilliertem Wasser in den Raum zwischen den Brunnen um Verdunstung des Kulturmediums zu verhindern.
2. Beschichtung-Zell-Linien
   Hinweis: Dieses Protokoll ist nur ein Beispiel für Transfektion in Zellen von Säugetieren Zelllinien, wie HeLa-Zellen und COS-7 Zellen. Benutzer können andere Transfektion Protokolle anwenden, die für ihre Experimente optimiert sind. In diesem Abschnitt beschreiben wir die HeLa-Zelle-Kultur-Protokoll, das auch auf COS-7 Zellen anwendbar ist.
   1. Am Vortag die Transfektion Kultur der Zellen in der Kulturschale von 10 cm bis sie Zusammenfluss von 70 – 90 % erreichen.
   2. Prewarm das Kulturmedium (siehe Tabelle der Materialien) auf 37 ° C.
   3. Waschen Sie die Zellen 2 X mit Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung ohne Ca^{2 +} und Mg^{2 +} (PBS [-]).
   4. Aspirieren Sie die PBS(-), fügen Sie 1 mL 0,5 % Trypsin-Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA) Lösung und inkubieren Sie die Zellen bei 37 ° C für 90 s bis sie eine Runde Form erreichen.
   5. Fügen Sie 9 mL vorgewärmte Kulturmedium, die Trypsinization zu stoppen. Verdünnen Sie die Zellen mit Nährmedium in einem Verhältnis von 1:6.
   6. Samen 1 mL der verdünnten Zellen auf PEI-beschichtete Deckgläsern in der 12-Well-Platten.
3. Vorbereitung der hippocampal Neuronen-Astrozyten gemischte Kultur von Ratten oder Mäusen
   Hinweis: Abschnitte 1.3 und 1.4 müssen zuerst überprüft werden, und durch eine institutionelle Tier Pflege und verwenden Ausschuss genehmigt und müssen behördlich genehmigten Verfahren für die Pflege und Verwendung von Labortieren. Das Flussdiagramm des neuronalen Kultur Protokolls ist in Abbildung 2dargestellt.
   1. Bereiten Sie alle Reagenzien unter der Laminar-Flow-Haube. Ort Dulbecco modifizierte Eagle Medium (DMEM) in zwei 100 mm Kultur Gerichte (ca. 20 mL/Gericht), die in ein Eisschrank.
   2. 50 mL des Mediums Dissektion bestehend aus DMEM und 20 mM 4--(2-hydroxyethyl)-1-Piperazineethanesulfonic-Säure (HEPES) vorbereiten (siehe Tabelle der Materialien) und verzichten Sie das Medium in drei 60 mm Kultur Gerichte (ca. 7 mL/Gericht) und acht 35 mm Kultur-Gerichte (ca. 2 mL/Gericht). Legen Sie die Gerichte in einer anderen Kühlbox.
   3. Bereiten Sie die Inkubation Kochsalzlösung, bestehend aus Hanks ausgeglichene Salzlösung ergänzt mit 20 mM HEPES (siehe Tabelle der Materialien), 50 mL und legen Sie 8 mL Saline in einem 15 mL konische Röhrchen auf Eis.
   4. Bereiten Sie die Beschichtung Medium mit minimalen wesentliche Medium (MEM) ergänzt mit B-27, Glutamin und Penicillin-Streptomycin (siehe Tabelle der Materialien). Pflegen Sie dieses Medium bei Raumtemperatur (20 – 28 ° C).
   5. Die chirurgischen Instrumente mit 70 % Ethanol zu sterilisieren.
   6. Platzieren Sie ein Papiertuch in einem Glas mit Deckel und 1 mL Isofluran. Die Isofluran für 1 min verdunsten zu lassen.
   7. Eine schwangere Ratte oder Maus in das Glas nach Schritt 1.3.6 zubereitet und das Tier in das Glas halten, bis es tief narkotisiert ist (ca. 30 s, 1 min).
   8. Narkotisierten Tier aus dem Glas nehmen und das Tier und die Dissektion Ausrüstung durch Besprühen mit 70 % igem Ethanol zu desinfizieren. Schneiden der ventralen Mittellinie mit standard sezierenden Scheren und Pinzetten und die Gebärmutter aus dem schwangere Ratte oder Maus zu extrahieren.
   9. Extrahieren von E18 – 19 Embryonen aus der Gebärmutter eines weiblichen narkotisierten Ratte oder Maus, mit zarten sezierenden Schere, und legen Sie die extrahierten Embryonen mit einem Ring-Zangen in eiskalten DMEM in einer 10 cm Petrischale für kalte Anästhesie.
   10. Enthaupten Sie den Embryo mit einer Schere fein Dissektion und legen Sie den Kopf in eiskalten DMEM in einer 10 cm Petrischale.
   11. Extrahieren Sie das Gehirn von jedem Embryo mit einem 13 cm gebogen Semken Zangen und Pinzetten mit feinen Spitzen. Halten Sie das Gehirn im eiskalten Dissektion Medium in einer 60 mm Schale.
   12. Entfernen Sie der Hippocampi, mit zwei Pinzetten mit feinen Spitzen, im eiskalten Dissektion Medium in 35 mm Schalen und pflegen Sie das isolierte Gewebe in der Inkubation Kochsalzlösung in einem 15 mL konische Röhrchen auf Eis gelegt.
   13. Die Hippocampi mit Inkubation Kochsalzlösung waschen und mit Trypsin (1,25 mg/mL) und DNase ich (0,25 mg/mL) in den Salinen Inkubation für 5 min bei 37 ° c inkubieren Das empfohlene Inkubation Volumen beträgt 2,7 mL die Inkubation Kochsalzlösung, 150 µL 20 x Lager Trypsin und 150 µL 20 X Lager DNase (siehe Tabelle der Materialien).
   14. Waschen Sie die Hippocampi 3 X mit eiskalten Inkubation Kochsalzlösung.
   15. Aspirieren Sie die Inkubation Kochsalzlösung und 1 mL des Mediums Beschichtung mit DNase ich (10 µL der Stammlösung; siehe Tabelle of Materials). Aussetzen Sie des Gewebes durch Pipettieren nicht mehr als 20 X und Messen Sie die Dichte der lebensfähigen Zellen, mit einer Zelle Zähler und Trypan blau-Assay.
   16. Verdünnen der hippocampalen Zellen zu einer Dichte von 1,4 x 10⁵ lebensfähige Zellen/mL für Ratten und 2,5 x 10⁵ lebensfähige Zellen/mL für Mäuse. Samen Sie 1 mL der verdünnten Zellsuspensionen auf den PEI-beschichtete Deckgläsern in Kultur 12-Well-Platten.
   17. Pflegen Sie die Zellen bei 37 ° C in einem CO2-Inkubator für 2 – 3 Tage.
   18. Die Beschichtung Medium zu entfernen. Lassen Sie sich nicht die Zellen austrocknen. Sanft und schnell hinzufügen das vorgewärmte Wartung Medium (siehe Tabelle der Materialien).
4. Vorbereitung der Ratte kortikale Neuronen-Astrozyten gemischte Kultur und gefrorene Zellen und die Wiederbelebung der gefrorenen Kulturen
   Hinweis: Es war eine Kryokonservierung Methode für kortikale Zellen beschrieben previously11. Hier ist ein modifiziertes Protokoll in der kortikale Zellen bei-80 ° C für mindestens 3 Monate gelagert werden können zur Verfügung gestellt. Das Flussdiagramm für dieses Protokoll ist in Abbildung 2dargestellt.
   1. Bereiten Sie vor, DMEM, Präparation, Inkubation Kochsalzlösung, und Beschichtung Medium gemäß Schritte 1.3.1–1.3.4, und die Tabelle der Materialien.
   2. Bereiten Sie das Waschen Medium konstituiert DMEM, Hitze-inaktivierten fötalen Rinderserum und Penicillin-Streptomycin (siehe Tabelle der Materialien), falls erforderlich.
   3. Extrahieren Sie E18-19 Embryonen aus der Gebärmutter eines weiblichen narkotisierten Ratte oder Maus, mit zarten Dissektion Schere, und verwenden Sie Ring Zange, um jede extrahierte Embryo in eiskalten DMEM für kalte Anästhesie zu platzieren.
   4. Entfernen Sie die Gehirne von Embryonen und im eiskalten Dissektion Medium aufbewahren. Entfernen Sie die Cortexes und pflegen sie in der Inkubation Kochsalzlösung in einem 15 mL konische Röhrchen auf Eis gelegt.
   5. Waschen Sie die Cortexes mit Inkubation Kochsalzlösung und inkubieren Sie Cortexes mit Trypsin (1,25 mg/mL) und DNase I (0,25 mg/mL) Inkubation Kochsalzlösung für 5 min bei 37 ° C. Die empfohlene Inkubation für 12 Cortexes beträgt 5,4 mL Kochsalzlösung Inkubation, 300 µL 20 x Lager Trypsin und 300 µL 20 X Lager DNase ich.
   6. Waschen Sie die Cortexes 3 X mit eiskalten Inkubation Kochsalzlösung.
   7. Entfernen Sie den Überstand zu und fügen Sie 2 mL Beschichtung Medium ergänzt mit 150 µL DNase Lager. Distanzieren Sie die Zellen von weniger als 20 Schlägen pipettieren, und Filtern Sie die Zellen mit einer Zelle Sieb mit einer Porengröße von 70 µm.
   8. Waschen Sie die Zelle Sieb mit 20 mL des Mediums Beschichtung für Beschichtung. Für die Zubereitung von gefrorenen Zellen bestand, waschen Sie die Zellen mit 20 mL des Mediums zu waschen (siehe Tabelle der Materialien)
   9. Die Dichte der lebensfähigen Zellen, mit einer Zelle-Theke und die Trypan blau-Methode zu messen.
   10. Verdünnen Sie die kortikalen Zellen zu einer Dichte von 1,4 x 10⁵ lebensfähige Zellen/mL mit dem Überzug-Medium und PEI-beschichtete Deckgläsern in die Kultur 12-Well-Platten fügen Sie 1 mL verdünnter Zellsuspension hinzu.
   11. Halten Sie die Zellen bei 37 ° C in einem CO-₂ -Inkubator für 2 – 3 Tage und ändern Sie das Kulturmedium in Wartung-Medium.
   12. Bereiten Sie nach Schritt 1.4.9 den gefrorenen kortikalen Zelle bestand durch Zentrifugieren der Zellen bei 187 X g für 3 min mit einem Swing-Rotor.
   13. Den Überstand abgesaugt und fügen Sie die Kryokonservierung Medium (siehe Tabelle der Materialien) bei 4 ° C gehalten, um eine Zelldichte von 1 x 10⁷ Zellen/mL zu erhalten. Aliquoten 1 mL Zellsuspension in Kryo Röhrchen.
   14. Platzieren Sie die Rohre in einer Zelle Einfrieren Behälter mit einer einfrierende Rate von-1 ° C/min, bis eine Temperatur von-80 ° C erreicht ist, und übertragen Sie den eiskalten Container auf-80 ° C Gefrierschrank. Die Zellen können für mindestens 3 Monate bei-80 ° c gelagert
   15. Um die gefrorenen Zellen wieder zu beleben, prewarm der Wäsche (ca. 13 mL für jedes Kryo Röhrchen) und Wartung Medium für gefrorene kortikalen Zellen (siehe Tabelle der Materialien).
   16. Tauen Sie die gefrorenen Zellen schnell bei 37 ° C in einem Wasserbad.
   17. Verdünnen Sie die aufgetauten Zellen sanft mit vorgewärmte waschen Medium. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 187 X g für 3 min mit einem Swing-Rotor.
   18. Auszusetzen Sie das Pellet in 1 mL Medium Wash und Messen Sie die tragfähige Zelldichte.
   19. Verdünnen Sie die Zellen mit dem Pflege-Medium für gefrorene kortikalen Zellen eine Zelldichte von 3,0 x 10⁵ lebensfähige Zellen/mL und 1 mL Zellsuspension in PEI-beschichtete 12-Well Platten Samen liefern.

(2) Ausdruck der Membran-gezielte GECIs

1. Transfektion von Zellen
   1. Fügen Sie 250 ng des Plasmids GECI (d. h. Lck-GCaMP6f, Lck-RCaMP2 oder OER-GCaMP6f mit CMV-Promoter)^7,8,9 , 100 µL des Mediums reduzierte Serum (siehe Tabelle der Materialien) pro Bohrloch. Für die Cotransfection von Lck-RCaMP2 und OER-GCaMP6f, Einsatz 250 ng jeder Plasmids in 100 µL reduzierte Serum Medium in jede Vertiefung.
   2. Hinzufügen von 0,5 µL Transfection Reagens (siehe Tabelle der Materialien) pro Bohrloch in das Plasmid-reduzierte Serum mittlere Mischung. Fügen Sie für die Cotransfection von Lck-RCaMP2 und OER-GCaMP6f 0,5 µL Transfection Reagens pro Bohrloch.
   3. Inkubieren Sie die Mischung für 30 min bei Raumtemperatur (20 – 28 ° C).
   4. Jede Deckglas 100 µL der Mischung in einer drop-wise Art und Weise hinzufügen.
   5. Inkubieren Sie die Zellen für 48-72 h in einem CO₂ Inkubator bei 37 ° C erlauben den Ausdruck der GECIs.
2. Transfektion und Adeno-assoziierten Virus-Infektion des Hippokampus oder kortikale Neuronen
   Hinweis: Transfektion für 3 – 5 Tage in vitro (DIV) führt zu einer höheren Rate der Transfektion für Neuronen. Transfektion auf 6 – 8 DIV wird bevorzugt für den optimalen Ausdruck von GECIs in Astrozyten. Für den Ausdruck von GECIs in dissoziierten Kultur Neuronen nach 9 DIV stellt die Infektion der Adeno-assoziierte Virus (AAV) Vektoren eine bessere Wirksamkeit der Ausdruck. AAV-Vektoren für den Ausdruck von Lck-GCaMP6f, Lck-RCaMP2 und OER-GCaMP6f unter der EF1a Promotoren vorbereitet wurden, wie zuvor beschrieben, mit HEK293 Zellen¹² (siehe Tabelle der Materialien).
   1. Zur Transfektion 3 – 8 Tage nach der Beschichtung Label zwei Röhren, eine für Plasmid-DNA und die andere für Transfection Reagens.
   2. 50 µL reduzierte Serum Medium hinzufügen (siehe Tabelle der Materialien) pro Bohrloch um jedes Rohr.
   3. Fügen Sie 0,5 µg Plasmid DNA pro Deckglas und 1 µL Ergänzung begleitet von Transfection Reagens für Neuronen (siehe Tabelle der Materialien hinzu) pro Bohrloch der Plasmid-DNA-Röhre. Für die Cotransfection von Lck-RCaMP2 und OER-GCaMP6f werden 0,5 µg jedes Plasmid und 1 µL Ergänzung in 50 µL reduzierte Serum Medium pro Bohrloch gemischt.
   4. Fügen Sie 1 µL Transfection Reagens (siehe Tabelle der Materialien) pro Bohrloch im Transfection Reagens Rohr. Die gleiche Menge an Transfection Reagens wird für Cotransfection verwendet.
   5. Vortex beide Röhren für 1 – 2 s.
   6. Fügen Sie die Transfektion Reagenz Mischung (aus Schritt 2.2.4), das DNA-Gemisch (aus Schritt 2.2.3). Durch Pipettieren vorsichtig mischen und die Mischung (100 µL pro Deckglas) für 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
   7. Laden Sie diese Mischung auf die Zellen in einer drop-wise Weise.
   8. 2 – 3 Tage, bis der Marker-Proteine exprimiert werden inkubieren Sie die Zellen in einem CO₂ Inkubator.
   9. Fügen Sie 3 µL AAV pro Bohrloch AAV-Infektion hinzu die gemischte Neuron-Astrozyten Kultur. Mischen Sie durch Schaukeln die Schüssel vorsichtig. Für die doppelte Infektion von Lck-RCaMP2 und OER-GCaMP6f wird jedes AAV 3 µL pro Bohrloch eingeführt. Für den Fall, dass die Anzahl der Zellen mit dem Ausdruck GECIs nicht ausreichen, sollte die optimale Menge der AAV für Infektion bestimmt werden.
   10. Pflegen Sie die Kultur, für 1 – 2 Wochen, bis die GECIs ausgedrückt werden.

(3) Ca^{2 +} Imaging

1. Gleichzeitige Darstellung von Zellen mit dem Ausdruck Lck-RCaMP2 und OER-GCaMP6f
   Hinweis: Sind gleichzeitig aufzeichnen die Lck-RCaMP2 und OER-GCaMP6f Signale, Bild-splitting Optik erforderlich. Die Optik ermöglichen die Trennung von RCaMP2 und GCaMP6f und ihre Projektion auf die gleichen fotografischen Rahmen der Kamera (Abb. 3A). Simultane Bildgebung auch erfordert (1) Lichtquellen, die gleichzeitig Anregungslicht in blau (450-490 nm emittieren können) und grün (500-560 nm) Spektren, (2) Doppel-Band Filter und dichroitischen Spiegel setzt im Mikroskop und (3) Emission Filter für RCaMP2 und GCaMP6f. Einzelheiten finden Sie auf die Tabelle der Materialien.
   1. Aktivieren Sie die imaging-Geräte und Computer mindestens 30 min vor der Aufnahme. Prewarm das Mikroskop Heizung Kammer auf 37 ° C. Richten Sie die Bild-splitting Gerät, Filter und Lichtquelle. Richten Sie die Bild-splitting Optik so aus, dass die gleiche Sichtfeld auf der Kamera angezeigt wird. Wählen Sie das entsprechende Objektiv (siehe Tabelle der Materialien).
   2. Mount das Deckglas, enthalten die Zellen mit Lck-RCaMP2 transfiziert und OER-GCaMP6f in der Aufnahme-Kammer, fügen Sie die entsprechenden bildgebendes Medium oder Puffer (400 µL für 18 mm Deckgläsern) in der Kammer, und legen Sie es auf den Mikroskoptisch. Deckel auf die Aufnahme-Kammer, die Verdunstung des Mediums zu vermeiden.
   3. Suchen Sie die Zellen mit dem Ausdruck Lck-RCaMP2 und OER-GCaMP6f durch Fluoreszenz-Bildgebung. Minimieren Sie die Erregung Lichtintensität um Immunofluoreszenz und Phototoxizität zu verhindern.
   4. Entfernen Sie den Deckel und starten Sie eine Zeitrafferaufnahme bei 10 Hz. Während dieser Aufnahme fügen Sie Agonisten an die Kammer, Ca^{2 +} Antworten (z. B. Histamin für HeLa-Zellen, ATP für COS-7 Zellen) zu erwähnen hinzu.
   5. Die Zeitraffer-Daten in der Festplatte (HDD) speichern.
   6. Analysieren Sie die Daten mithilfe von Bildanalyse-Software.
2. Spontane Aufnahmetätigkeit der Astrozyten Ausdruck Lck-RCaMP2 und OER-GCaMP6f
   Hinweis: Ohne Bild-splitting Optik können die Ca^{2 +} Signale an die Plasmamembran und Mitmenschen die ER in derselben Zelle überwacht werden. Hier ist die sequentielle Erfassung von Lck-RCaMP2 und OER-GCaMP6f in der gleichen Astrozyten beschrieben. Ein Öl-Immersion-Ziel mit einer numerischen Apertur größer als 1,3 ist empfehlenswert für spontane Ca^{2 +} Aktivität.
   1. Schalten Sie das Mikroskop, Kamera, Lichtquelle und das Mikroskop Heizung Kammer mindestens 30 min vor der Aufnahme.
   2. Montieren Sie das Deckglas der Zellen mit Lck-RCaMP2 und OER-GCaMP6f in der Aufnahme Kammer transfiziert und fügen Sie 400 µL des Mediums imaging hinzu. Legen Sie einen Deckel auf die Kammer.
   3. Wählen Sie den Filter set für GCaMP6f und der Lichtquelle (blaue Anregungslicht, z. B. 470– 490 nm; siehe Tabelle of Materials). Suchen Sie die Astrozyten OER-GCaMP6f zum Ausdruck zu bringen.
   4. Wählen Sie einen Filter-Set und die Lichtquelle für RCaMP2 (grüne Anregungslicht, z. B. 510 – 560 nm; siehe Tabelle of Materials) und bestätigen, ob Lck-RCaMP2 in der gleichen Astrozyten ausgedrückt wird. Vermeiden Sie lange die Lichtquelle, Immunofluoreszenz zu verhindern.
   5. Zeitraffer-Aufnahmen von Lck-RCaMP2 bei 2 Hz für 2 min. Speichern der Bilddaten auf der Festplatte.
   6. Ändern Sie den Filter stellen Sie für GCaMP6f. Zeitraffer-Aufnahmen von OER-GCaMP6f in der gleichen Sichtfeld bei 2 Hz für 2 min. sichern Sie die Daten auf der Festplatte.
   7. Analysieren Sie die Daten mit Hilfe der Bildanalyse-Software.
3. Aufzeichnung von spontanen neuronalen Aktivität und induzierte Ca^{2 +} Höhe in Neuronen
   Hinweis: Das Mikroskop-Setup für neuronale Bildgebung ist die gleiche wie die in Abschnitt 3.2 beschrieben. Hier ist die Darstellung der spontanen Ca^{2 +} Höhe durch Lck-GCaMP6f und Ca^{2 +} Höhe induziert durch mGluR-Aktivierung durch OER-GCaMP6f beschrieben.
   1. Um spontane neuronaler Aktivität aufzuzeichnen, montieren Sie das Deckglas, enthalten die Zellen mit dem Ausdruck Lck-GCaMP6f in der Aufnahme-Kammer zu und fügen Sie 400 µL von imaging-Medium. Legen Sie einen Deckel auf die Kammer.
   2. Soll der Filter und der Lichtquelle (blaue Erregung, z. B. 470 – 790 nm; siehe Tabelle of Materials) für GCaMP6f. Finden Sie die Neuronen mit dem Ausdruck Lck-GCaMP6f und spontane Aktivität zeigen.
   3. Bilder mit 2 Hz oder schneller zu erwerben. Speichern Sie die Daten auf der Festplatte.
   4. Analysieren Sie die Daten mit Hilfe der Bildanalyse-Software.
   5. Zum Aufzeichnen von induzierten Ca^{2 +} Höhe montieren die Deckgläsern, enthalten die Zellen mit dem Ausdruck OER-GCaMP6f mit 400 µL Medium imaging. Legen Sie einen Deckel auf die Kammer.
   6. Mit dem Filter set für GCaMP6f, die Neuronen, die mit dem Ausdruck OER-GCaMP6f zu finden.
   7. Den Deckel abnehmen. Starten Sie die Zeitraffer-Aufnahme mit 2 Hz oder schneller. Während der Aufnahme hinzufügen die Agonisten für ein Gq-Protein-gekoppelten Rezeptoren (z. B. mGluR5 Agonist [RS] - 3,5 - Dihydroxyphenylglycine [DHPG]), eine Ca^{2 +} Befreiung von der Notaufnahme zu erwähnen.
   8. Die Zeitraffer-Bilder auf der Festplatte speichern und analysieren der Daten.

Representative Results

LCK-RCaMP2 und OER-GCaMP6f wurden in HeLa-Zellen ausgedrückt, und beide Signale gleichzeitig mit Bild-splitting Optik, 24 h nach Transfektion (Abb. 3A und Video 1) aufgezeichnet wurden. Die Bilder wurden bei 10 Hz. Histamin (seiner 1 µM), die induziert Ca^{2 +} Entlassung aus der Notaufnahme, wurde hinzugefügt, während der Aufnahme erworben. Auf Antrag seiner erhöht die Signalintensität von Lck-RCaMP2 und OER-GCaMP6f, dargestellt durch die Pseudofarben Anzeige von ΔF/F0, die die Änderung von der ursprünglichen Fluoreszenzintensität (Abb. 3 b) darstellt. Die Zeit-Kurse von Ca^{2 +} Höhe (ΔF/F0) berichtet von Lck-RCaMP2 und OER-GCaMP6f wurden in der gleichen Region of Interest (ROI) (Abbildung 3) verglichen. Die ΔF/F0-Werte wurden auf ihre Spitzenwerte der Zeit Kurs Vergleich zwischen die zwei verschiedenen GECIs ermöglichen die verschiedenen Ausdruck Niveaus und Distributionen haben normalisiert. Beide Sensoren berichtet eine Schwingung wie Ca^{2 +} Höhe. LCK-RCaMP2 und OER-GCaMP6f zeigte den gleichen zeitlichen Verlauf für Ca^{2 +} Höhe in zwei Zellen unter den fünf Zelle Arten untersucht (Abbildung 3, ROI 1 und 3). Ca^{2 +} Erhebungen gezeigt von Lck-RCaMP2 blieb jedoch auf einer höheren Ebene im Vergleich dazu von OER-GCaMP6f (Abb. 3 C, ROI, 2, 4 und 5) gezeigt. Die Ergebnisse zeigen, dass die Ca^{2 +} Höhe in der Nähe der Plasmamembran verlängert wird, während es früher um das ER gekündigt wird, welches ist die Quelle dieses Ca^{2 +} Signal induziert durch seine Stimulation.

Spontane Ca^{2 +} -Signale von Astrozyten in der Neuron-Astrozyten gemischte Kultur von Ratte Hippokampi (Abbildung 4A) und Cortexes (Abbildung 4 b) zeigten sich von Lck-RCaMP2 und OER-GCaMP6f (Abbildung 4, Video 2, Video 3 , 4 Videound Video 5). Kortikale Kulturen wurden aus dem gefrorenen bestand wieder belebt, die vorbereitet wurde, wie in diesem Protokoll beschrieben. LCK-RCaMP2 und OER-GCaMP6f Signale wurden nacheinander bei 2 Hz aus den gleichen Zellen aufgenommen. Drei ROIs in der Gegend, die Ca^{2 +} Höhe zeigte von jedem GECI ausgewählt wurden, und der zeitlichen Verlauf der ΔF/F_Basis (d. h. der Fluoreszenzintensität) geändert von der durchschnittlichen Fluoreszenzintensität während der gesamten Aufzeichnungsdauer (F_Basis ). Wenn die Basislinie Fluoreszenz stabil ist und Ca^{2 +} Höhen seltener sind, wird F_Basis eine nützliche Grundlage für Ca^{2 +} Höhe-Ereignisse zu erkennen. Spontane Ca^{2 +} Höhen waren sichtbar, nur bei den astrocytic Process, nicht an den Zellkörper. Dieses Ergebnis steht im Einklang mit der früheren Berichten über astrocytic spontan Ca^{2 +} Signale von anderen GECIs visualisierte in-vitro-¹³ und in-vivo-¹⁴. Im Hippokampus und kortikalen Astrozyten waren Ca^{2 +} Erhebungen gezeigt von Lck-RCaMP2 (oben) häufiger als diejenigen von OER-GCaMP6f gezeigt. Dieses Ergebnis steht im Einklang mit unserer früheren Demonstration, dass Ca^{2 +} Erhebungen in Astrozyten durch Lck-GCaMP6f häufiger als die durch OER-GCaMP6f⁷ erkannt wurden und legt nahe, dass dieser Begriff auch auf die einzellige Ebene.

Spontane Ca^{2 +} Höhen von Lck-GCaMP6f in unreifen Ratte hippocampal Neuronen (10 DIV) wurden bei 2 Hz (Abb. 5A und Video 6) gesehen. Die Zeit-Kurse von ΔF/F0 in fünf verschiedenen ROIs legen nahe, dass diese Ca^{2 +} Erhebungen vor Ort auf der subzellulären Domänen beschränkt sind. Abbildung 5 b (Video 7) zeigt die Ca^{2 +} Antworten in reife Maus hippocampal Neuronen (30 DIV) mit OER-GCaMP6f-Ausdruck AAV-Vektoren infiziert. Neuronen wurden mit 100 µM DHPG, stimuliert die Agonisten für metabotropen Glutamatrezeptoren, induzierende Ca^{2 +} Release ist. DHPG-induzierte Ca^{2 +} Freigabe durch OER-GCaMP6f wurde erkannt.

Abbildung 1: Diagramm mit Membran-gezielte GECIs. Schematische Darstellung der Plasmamembran ausgerichtete GECIs (Lck-GCaMP6f und Lck-RCaMP2) und äußeren ER Membran-bezogenen GCaMP6f (OER-GCaMP6f).

Abbildung 2: Flussdiagramm für hippocampal und kortikalen Zelle Vorbereitung, Plasmid Transfektion und AAV Infektion. Die mikroskopischen Aufnahmen sind repräsentativ, frisch vergoldeten DIV-6 kortikale Zellen (links) und Zellen aus dem gefrorenen bestand (rechts) wiederbelebt. Maßstabsleiste = 100 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 3: Beispiel für die gleichzeitige Darstellung von Lck-RCaMP2 und OER-GCaMP6f in HeLa-Zellen. (A) schematische Darstellung der Signaltrennung mit Bild-splitting-Optik. Die gleiche Sichtfeld für Lck-RCaMP2 und OER-GCaMP6f wird gleichzeitig an der Kamera projiziert. Eine repräsentative Aufnahme erworben bei 10 Hz mit einer CMOS-Kamera finden Sie in Video 1, und ein Bild von dieser Aufnahme ist in zentrale A (rechts) angezeigt. (B) Pseudo-farbige Bilder von ΔF/F0 für Lck-GCaMP2 (oben) und OER-GCaMP6f (unten). Histamin (seiner, 1 µM) wurde am 0 S. (C) Vertreter normalisierten ΔF/F0 zeitlichen Verlauf der Lck-GCaMP2 (Magenta) und OER-GCaMP6f (grün) hinzugefügt. Daten wurden auf den maximalen ΔF/F0-Wert für jedes Grundstück normalisiert. Der graue Balken zeigt den Zeitpunkt seines Antrags. Daten wurden mit einer maßgeschneiderten Software TI Workbench¹⁵analysiert. Maßstabsleiste = 50 µm (mikroskopische Bild).  Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 4: Spontane Ca^{2 +} Höhe in Astrozyten überwacht Lck-RCaMP2 und OER-GCaMP6f. (A) Vertreter hippocampal und (B) kortikale Astrozyten transfiziert mit Lck-RCaMP2 (oben) und OER-GCaMP6f (unten). Kortikale Zellen wurden aus gefrorenen Stammkulturen wiederbelebt. LCK-RCaMP2 und OER-GCaMP6f Bilder wurden nacheinander in derselben Zelle, bei 2 Hz mit einer EM-CCD Kamera erworben. Die Grundstücke auf dem linken erscheinen die Zeit Kurse von ΔF/Nutzun ROIs gemessen in das mikroskopische Bild angegeben. Daten wurden mit TI-Workbench analysiert. Aktuelle Filme werden in Video 2, Video 3 Video 4und 5 Videobereitgestellt. Die Maßstabsleiste = 20 µm (mikroskopische Bild). Die Baseline Drift schlägt die Änderungen in der globalen Ca^{2 +} Ebene in der Zelle.  Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 5: Beispiele für Ca^{2 +} Bildgebung in Neuronen mit Lck-GCaMP6f und OER-GCaMP6f. (A) repräsentative Ratte hippocampal Neuronen Lck-GCaMP6f DIV 10 (links) und Grundstücke zeigt die Zeit, die Kurse von ΔF/F0 gemessen in ROIs (gelbe Kreise) angegeben worden im Bild (rechts) zum Ausdruck zu bringen. Die Zahlen in den zeitlichen Verlauf entsprechen die ROI-Zahlen im Bild. Beachten Sie, dass das zeitliche Muster der Ca^{2 +} Höhe unterschiedlich zwischen den verschiedenen Regionen von Interesse ist. Die Baseline Drift schlägt die Erhöhung der globalen Ca^{2 +} Ebene in diesem Neuron. (B) ein Beispiel für reife Maus hippocampal Neuronen (DIV 30) infiziert mit OER-GCaMP6f Ausdruck AAV Vektoren (links). Die Zeit, die Kurs-Plot von ΔF/F0 gemessen Ca^{2 +} Antwort bis 100 µM zeigt angewendet (RS) - 3,5 - Dihydroxyphenylglycine (DHPG) auf das Timing durch die graue Leiste angezeigt. Gelbe Kreise zeigen die Position des ROIs, der zeitlichen Verlauf ermittelt wurden. Die Bilder wurden bei 2 Hz mit einer gekühlten CCD Kamera (zentrale A) oder einer EM-CCD-Kamera (Gruppe B) erworben und mit TI-Workbench analysiert. Maßstabsleiste = 20 µm (mikroskopische Bild). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Video 1: Beispiel für gleichzeitige Darstellung von Lck-RCaMP2 und OER-GCaMP6f in HeLa-Zellen. Repräsentative Aufnahme bei 10 Hz erworben und in Abbildung 3dargestellt. Maßstabsleiste = 50 µm.  Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterladen.

Video 2: Spontane Ca^{2 +} Transient in Lck-RCaMP2 im Hippokampus Astrozyten beobachtet. Repräsentative Aufnahme erworben bei 2 Hz (Abb. 4A), aufgenommen im gleichen Sichtfeld als Video 3. Maßstabsleiste = 20 µm. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterladen.

Video 3: Spontane Ca^{2 +} Transient in OER-GCaMP6f im Hippokampus Astrozyten beobachtet. Repräsentative Aufnahme bei 2 Hz (Abb. 4A), im gleichen Sichtfeld als Video 2erworben. Maßstabsleiste = 20 µm. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterladen.

Video 4: Spontane Ca^{2 +} Transient in Lck-RCaMP2 in einer kortikalen Astrozyten beobachtet repräsentative Aufnahme erworben bei 2 Hz (Abbildung 4 b), aufgenommen im gleichen Sichtfeld als Video 5. Maßstabsleiste = 20 µm. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterladen.

Video 5: Spontane Ca^{2 +} Transient beobachtet in OER-GCaMP6f in einer kortikalen Astrozyten. Repräsentative Aufnahme bei 2 Hz (Abbildung 4 b), im gleichen Sichtfeld als Video 4erworben. Die Maßstabsleiste = 20 µm. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterladen.

Video 6: Beispiel für Ca^{2 +} Bildgebung in einem hippocampal Ratte Neuron (DIV 10) von Lck-GCaMP6f. Beispiel für neuronale Ca^{2 +} -Signale aufgezeichnet bei 2 Hz (Abb. 5A). Maßstabsleiste = 20 µm. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterladen.

Video 7: Ca^{2 +} Release in einem Maus hippocampal Neuron (DIV 30) mit dem Ausdruck OER-GCaMP6f. Beispiel für neuronale Ca^{2 +} Signale aufgezeichnet in einem Maus hippocampal Neuron mit OER-GCaMP6f Ausdruck AAV Vektoren (Abb. 5 b) infiziert. Das Neuron wurde angeregt, mit 100 µM Dihydroxyphenylglycine (DHPG) angewendet um 30 s, Ca^{2 +} Entlassung aus der Notaufnahme zu erwähnen. Maßstabsleiste = 20 µm. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterladen.

Discussion

Vielfältigen biologischen Ausgänge werden von Ca^{2 +} Signale eingeleitet. Ca^{2 +} ist ein vielseitiger intrazellulären Signal Bote. Decodierung Ca^{2 +} Signale an bestimmte Ausgänge evozieren wurde eine grundlegende biologische Frage, und Ca^{2 +} bildgebende Verfahren zu beschreiben, die Vielfalt der Ca^{2 +} Signale sind erforderlich. Die derzeit ausführliche Protokoll ermöglicht die Erkennung von unterschiedlichen Ca^{2 +} Signale an die Plasmamembran und ER (Abbildung 3 und Abbildung 4) und lokalen Ca^{2 +} Microdomains innerhalb einer Zelle (Abbildung 4 und Abbildung 5). Dies trägt zu beschreiben die Vielfalt der intrazellulären Ca^{2 +} Signale. Die zeitliche Auflösung von Ca^{2 +} signalisiert wurde auch verbessert, durch gezielte GECIs in der Plasmamembran und ER, weil es kann die Wirkung von einer dreidimensionalen Diffusion von Ca^{2 +} und GECIs selbst vermeiden, und es das Potenzial hat zu erkennen, die Augenblick der Ca^{2 +} Zustrom oder Ca^{2 +} Release, das auf der Membran auftritt.

Das Protokoll hat einige Einschränkungen. Benutzer sollten beachte bitte, dass die detektierten Signale die Summierung von "the Moment of Ca^{2 +} Zustrom oder Release sind" und "Ca^{2 +} verbreitet heraus aus der Originalquelle ca.^{2 +"} , vor allem für große Ca^{2 +} Signale. Zum Beispiel obwohl seine Anregung in HeLa-Zellen Ca evoziert befreien^{2 +} die ER, seine daraus resultierende Ca^{2 +} Signale, nicht nur indem ER gezielt OER-GCaMP6f, sondern auch durch Plasma-Membran-gezielte Lck-RCaMP2 (Abbildung 3 erkannt werden). Eine weitere Einschränkung ist, dass die räumlich-zeitliche Muster Ca^{2 +} Signale möglicherweise nicht der einzige bestimmende Faktor der Leistung von Ca^{2 +} Signale. Die Verteilung der nachgeschaltete Effektor-Proteine (z. B. Ca^{2 +}-abhängigen Kinasen und Phosphatasen) kann auch ein bestimmender Faktor². Um die intrazellulären Ca^{2 +} Signale vollständig zu entschlüsseln, ist Analyse der nachgeschalteten Enzym Verhalten, die in diesem Protokoll nicht abgedeckt ist, absolut notwendig.

Einer der kritischsten Aspekte für erfolgreiche Ca^{2 +} Imaging ist der bildgebenden Setup und Bild Erwerb Bedingungen, ebenso wie bei anderen live-Imaging-Studien. Bisher zeigten wir, dass Ca^{2 +} Reaktionen in der Zelle auf die Dauer und Intensität der Erregung und Bild Erwerb Bedingungen, einschließlich Belichtung Zeit und Übernahme Frequenz¹⁶sehr angewiesen sind. Erregerleistung Beleuchtung ist der kritischste Faktor, da es leichte Toxizität und Immunofluoreszenz GECIs verursachen kann. Die Aufnahmebedingungen der Exposition Zeiterfassung, Frequenz, Anregung Intensität und Dauer der Aufnahme sollte nach dem Zweck des Experiments optimiert werden. Es wird empfohlen, die Belichtungszeit und die Erregung Lichtintensität Immunofluoreszenz und Phototoxizität zur Zelle zu vermeiden so weit wie möglich reduzieren. Die Aufnahmefrequenz und die Dauer der Aufnahme sollte ausreichen, um die Ca^{2 +} Höhe Ereignisse von Interesse, aber sollte zur Vermeidung von Immunofluoreszenz und Phototoxizität auch möglichst gering gehalten werden. Wir empfehlen bestimmen zunächst die Aufnahmefrequenz und die Dauer und der Lichtintensität und der Belichtungszeit zu optimieren, so dass die Immunofluoreszenz die GECIs minimiert wird. Ein weiterer wichtiger Faktor ist der Ausdruck der GECIs. GECIs haben Ca^{2 +}-Pufferung Wirkung sind Ca^{2 +}-bindende Proteine. Daher führt die Überexpression von GECIs in die Pufferung von Ca^{2 +}, die physiologisch notwendig ist für die Zellen. Die Höhe der GECI Ausdruck sollte zur Vermeidung von bildgebenden Zellen mit dem Ausdruck hoher Mengen an GECIs minimiert werden.
 
Zusammenfassend ist das Sezieren von Ca^{2 +} Signale mit einer subzellulären Auflösung einer der wichtigsten Schritte für die Decodierung der intrazellulären Ca^{2 +} Signale, die die Ausgabe biologisches Phänomen zu bestimmen. Dieses Protokoll bietet eine neue Methode für das Sezieren von Ca^{2 +} Signale, die Vielfalt dieser Signale zu beschreiben. Derzeit beschränkt sich diese Technik für in-vitro-Experimente. Jedoch Lck-GCaMP6f dient bereits zur in-vivo Ca^{2 +} Bildgebung bei Mäusen¹⁷und OER-GCaMP6f bestätigt wurde, um Ca^{2 +} überwachen in vivo im VD motorischen Neuronen in C. Elegans7 signalisiert. Targeting GECIs subzelluläre Fach hat daher das Potenzial, erweitert werden, um in-vivo Bildgebung in der Zukunft so förderlichen Ca^{2 +} Dissektion in-vivo.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
(RS)-3,5-Dihydroxyphenylglycine (DHPG)	Tocris	#0342
0.5% DNase I stock solution	Sigma-Aldrich	#11284932001	Prepare 0.5% DNase I (w/v) in Hanks' Balanced Salt Solution  supplemented with 120 mM MgSO4. Prepare 160 µL aliquots and store at -30 °C.
0.5% Trypsin-EDTA solution	Thermo Fisher Scientific	#25300054
100 mM L-glutamine (×100 stock)	Thermo Fisher Scientific	#25030081	Preparing small aliquots of 250-750 µL and store at -30 °C.
100 mM Sodium pyruvate (×100 stock)	Thermo Fisher Scientific	#11360070	Aliquots (10 mL) can be stored at -20 °C. After thawing, the solution can be maintained at 4 °C for 2 months.
12-Well multiwell culture plates with low-evaporation lid	Falcon	#353043	Low-evaporation lid is critical for culturing neuron-glia mixed culture. For cell line cells, alternative culture dishes can be used.
18 mm diameter circular coverslips	Karl Hecht "Assistent"	#41001118	Thickness 1, 18 mm diameter circular coverslips; alternative coverslips can be used.
1 M HEPES	Thermo Fisher Scientific	#15630080	pH 7.2-7.6
2.5% Trypsin stock solution (×20 stock)	Sigma-Aldrich	#T4674	Prepare 150 µL aliquot and store at -30 °C.
50% Poly(ethyleneimine) (PEI) solution	Sigma-Aldrich	#P3143	Prepare 2% (V/V) PEI stock solution (×50) with distilled water sterilized by filtration. Store stock solution at -30 °C after preparing small aliquots of 250-750 µL. Prepare 0.04% PEI solution with distilled water on the day of coverslip coating.
70% Ethanol			Kept in a spray bottle to be used for surface disinfection.
Adeno-associated virus (AAV) for Lck-GCaMP6f, Lck-RCaMP2, and OER-RCaMP2 expression under the direction of the EF1a promoter			AAV can be prepared using AAV Helper Free System (Agilent Technologies) and HEK293 cells, or alternative methods. pAAV.EF1a.Lck-GCaMP6f, pAAV.EF1a.Lck-RCaMP2, and  pAAV.EF1a.OER-GCaMP6f are available upon request.
B-27 supplement (×50 stock)	Thermo Fisher Scientific	#17504044	This can be replaced by B-27 plus supplement (Thermo Fisher Scientific; #A3582801) or MACS NeuroBrew-21 (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany; #130-093-566).
B57BL/6	Japan SLC, Inc.
Camera for microscopic image recording			The following cameras were available for use: cooled-CCD camera (e.g., Hamamatsu Photonics, OECA-ER), EM-CCD camera (e.g., Hamamatsu Photonics,  ImagEM; Andor, iXon) or  CMOS camera (e.g., Hamamatsu Photonics ORCA-Flash4.0)
Cell freezing container	Sarstedt K.K.	#95.64.253	Alternative cell freezing container can be used.
Cell strainer	Falcon	#352350
CO2 incubator			Maintain at 37 °C, 5% CO2.
Cryogenic tube	Corning	#430661	Alternative cryogenic tubes can be used.
Cryopreservation medium	Zenoaq		"CELLBANKER1"
Culture medium (for HeLa cells)			Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) supplemented with 10% heat-inactivated fetal bovine serum, and penicillin-streptomycin solution (final concentration: Penicillin 100 U/mL and Streptomycin 100 µg/mL)
Dissection medium			One milliliter of 1 M HEPES (final concentration 20 mM) to 49 mL DMEM
DMEM	Nacalai	#08456-65	Alternative DMEM can be used.
DMEM	Nacalai	#08456-65	Low glucose
DNA transfection reagent	Sigma-Aldrich	#6366244001	"X-tremegene HP DNA transfection reagent" Alternative transfection reagents can be used.
Glass jar with a lid			500 mL jar (for mouse) or 1,500 mL jar (for rat) to anesthetize the animal
HBSS	Thermo Fisher Scientific	#14170161	HBSS free of calcium and magnesium
Heat inactivated bovine serum	Thermo Fisher Scientific	#10100147
HeLa cells	RIKEN BioResource Center	#RCB0007
Histamine	Sigma-Aldrich	#H7125
Image analysis software			Such as Metamorph (Molecular Devices), ImageJ (NIH), and TI Workbench14 (custom made)
Image splitting optics	Hamamatsu Photonics	#A12801-01	W-view GEMINI
Image splitting optics dichroic mirror	Semrock	#FF560-FDi01-25×36	For separation of green fluorescent protein/red fluorescent protein  (GFP/RFP) signal
Image splitting optics emission filters	Semrock	#FF01-512/25-25, #FF01-630/92-25	For emission of GFP/RFP signal, respectively
Imaging medium and buffer			Use optimal medium or buffer for the experiment. When medium is used, medium without phenol red is desirable to reduce background fluorescence. Add 20 mM HEPES to maintain pH outside of CO2 incubator.
Incubation saline			Add 1 mL of 1 M HEPES (20 mM) to 49 mL HBSS
Inverted fluorescence microscope			Such as IX73 (Olympus) or  Eclipse TI (Nikon Instech)
Isoflurane	Pfizer		Used for anesthesia
Maintenance medium (for 4 × 12 well dishes)			48.5 mL Neurobasal-A medium supplemented with 1 mL B-27, 500 µL of L-glutamine stock and 25 µL Penicillin-Streptomycin solution.
Maintenance medium for frozen cortical cells (for 1 × 12 well dishes)			12.2 mL Neurobasal plus medium supplemented with 250 µL B-27, 125 µL of L-glutamine stock and 6.2 µL Penicillin-Streptomycin solution.
MEM (Minimum Essential Medium)	Thermo Fisher Scientific	#11090-081
Microscope filter set for GCaMP6f imaging			Appropriate filter for GFP (excitation, 480 ± 10 nm; emission, 530 ± 20 nm)
Microscope filter set for RCaMP2 imaging			Appropriate filter for RFP (excitation, 535 ± 50 nm; emission, 590 nm long pass)
Microscope filter sets for double imaging of RCaMP2 and GCaMP6f	Semrock	#FF01-468/553-25, #FF493/574-FDi01-25×36, #FF01-512/630-25	Dual excitation filter, Dual dichroic mirror, and emission filter for GFP/RFP imaging.
Microscope heating system			A heating system to maintain cells at 37 °C during the imaging. To avoid drift caused by thermal expansion, heating systems covering the entire microscope itself (e.g., Tokai Hit, Thermobox) are recommended.
Microscope light source for excitation			Mercury lamp (100 W), xenon lamp (75 W), Light-emitting diode (LED) illumination system (e.g., CoolLED Ltd., precisExcite; Thorlabs Inc., 4-Wavelength LED Source; Lumencor, SPECTRA X light engine). In case of mercury lump and xenon lamp, use ND filter to reduce the excitation intensity.
Microscope objective lens			Plan-Apochromat oil immersion objective with numerical aperture higher than 1.3 is highly recommended for the recording of spontaneous Ca2+ activity in neurons and astrocytes.
Neurobasal plus medium	Thermo Fisher Scientific	#A3582901
Neurobasal-A Medium	Thermo Fisher Scientific	#10888022	Neurobasal plus medium (Thermo Fisher, A3582901) can be used instead of Neurobasal-A medium.
PBS(-): Phosphate-buffered saline free of Ca2+ and Mg2+	Fujifilm Wako Pure Chemical Cooperation	#164-23551	The absence of Ca2+ and Mg2+ is critical not to inhibit the trypsin activity. An alternative to PBS(-) can be used.
PC and image acquisition software			Such as Metamorph (Molecular Devices); Micromanager; TI Workbench14.
Penicillin-Streptomycin solution	Thermo Fisher Scientific	#15140122	Penicillin 10,000 U/mL and Streptomycin 10,000 µg/mL
Plasmid for Lck-GCaMP6f, Lck-RCaMP2, and OER-RCaMP2 expression under cytomegalovirus promoter 7-9			Available upon request
Plating medium (for 4 × 12 well dishes)			48 mL MEM supplemented with 1 mL B-27 supplement, 500 µL L-glutamine stock (final concentration: 2 mM), 500 µL of sodium pyruvate stock (1 mM) and 25 µL Penicillin-Streptomycin solution (penicillin 5 U/mL, streptomycin 5 µg/mL). This concentration of Penicillin-Streptomycin, which is 1/20 of  the concentration recommended by the manufacturer, is critical for neuronal survival.
Recording chamber	Elveflow	Ludin Chamber	This recording chamber is for 18 mm diameter round coverslips.
Reduced serum media	Thermo Fisher	#11058021	Opti-MEM
Stereomicroscope			Used to dissect hippocampi. Olympus SZ60 or equivalent stereomicroscopes are available.
Surgical instruments			Standard dissecting scissors to cut the abdomen of a mouse or a rat, tweezers to pinch the uterus, delicate dissecting scissors to cut the uterus and the head of embryo, ring forceps to pinch the embryos, 13 cm curved Semken forceps (Fine Science Tools #11009-13) to extract brains,  3 forceps with fine tips  (Dumont Inox #5)
Transfection reagent for neuron	Thermo Fisher Scientific	#L3000008	"Lipofectamine 3000" reagent. It is composed of the the "supplement (P3000)" that should be mixed with plasmid DNA in the step 2.2.3, and the "transfection reagent (lipofectamine 3000)" used in the step 2.2.4.
Trypan blue (0.4%)	Thermo Fisher Scientific	#15250061
Wash medium for frozen cortical cells			25 mL DMEM, supplemented with 250 µL heat-inactivated fetal bovine serum + 12.5 µL Penicillin Streptomycin.
Wistar rats	Japan SLC, Inc		Pregnant rats (E18)