Summary
여기 우리는 캘리포니아2 + 이미징 신경 그리고 glial 세포, 캘리포니아2 + 신호 subcellular 해상도 해 부를 수 있게 하는 프로토콜을 제시. 이 프로세스는 유전자 인코딩된 Ca2 + 지표의 식을 허용 하는 모든 셀 형식에 적용 됩니다.
Abstract
칼슘 이온 (캘리포니아2 +)은 다양 한 생물 학적 출력으로 이어지는 여러 개의 신호 경로 드라이브 보편적인 세포내 메신저 분자 이다. 두 캘리포니아2 + 신호 소스 조정-"Ca2 + 유입"에서 셀 외부 "캘리포니아2 + 릴리스"에서 세포내 Ca2 + 저장 바인딩과 그물 (ER)-기초 캘리포니아의 다양 한 spatio 시간적 패턴으로 간주 됩니다 2 + 셀에서 여러 생물 학적 기능을 일으키는 원인이 되는 신호. 이 프로토콜의 목적은 설명 새로운 Ca2 + 이미징 방법 "캘리포니아2 + 유입"와 "캘리포니아2 + 릴리스" 순간의 모니터링 하는 것입니다. OER-GCaMP6f는 유전으로 인코딩된 Ca2 + 표시기 (GECI) 구성 된 GCaMP6f는 응급실 외부 막에 대상 이다. OER-GCaMP6f Ca2 + 출시 기존의 GCaMP6f 보다 더 높은 시간 해상도 모니터링할 수 있습니다. 원형질 막 대상 GECIs와 결합, subcellular 해상도 spatio 시간적 캘리포니아2 + 신호 패턴을 설명할 수 있습니다. Subcellular 대상 Ca2 + 지표 설명, 원리, 모든 세포 유형에 사용할 수 있는에 vivo에서에 이미지 꼬마 선 충 의입니다. 이 프로토콜에서 우리 세포, 뉴런, 그리고 해리 주 문화, glial 세포에서 캘리포니아2 + 영상 셀에 소개 하 고 쥐 대뇌 피 질의 뉴런의 냉동된 재고의 준비를 설명.
Introduction
캘리포니아2 + 신호는 세포내 캘리포니아2 + 농도의 고 도를 나타냅니다. 캘리포니아2 + 진 핵 세포에 대 한 보편적인 두 번째 메신저입니다. 를 사용 하 여 Ca2 +세포 다양 한 세포내 신호 통로 통해 작동 하 고 다양 한 생물 학적 출력을 유도. 예를 들어 뉴런, 시 냅 스 소포 릴리스 연 접 맨끝에 있는 유전자 발현, 핵에는 postsynapse에서 시 냅 스가 소성의 유도 고유한 Ca2 + 신호를 정확 하 게 적절 한 활성화에 의해 통제 된다 다운스트림 효소와 정확한 타이밍1오른쪽 사이트에서.
캘리포니아2 + 신호 특정 spatiotemporal 패턴 특정 다운스트림 효소를 활성화합니다. 캘리포니아2 + 신호를 두 개의 서로 다른 Ca2 + 소스 사이의 조정에 의해 생성 됩니다: 세포 외 공간 및 바인딩과 그물 (응급실), 세포내 캘리포니아 2 +역할에서 Ca2 + 방출 캘리포니아2 + 유입 저장. 의미 있는 spatiotemporal 캘리포니아2 + 신호 패턴을 유도 하는 특정 세포의 기능 10-100 µ M Ca2 + 캘리포니아2 + 원형질 막 또는 ER 막2채널 주변에서 생성 된 nanodomains에 의해 지원 됩니다. 중요 한 것은, 캘리포니아2 + 신호 소스 다운스트림 생물 출력을 결정 하는 가장 중요 한 요인 중 하나입니다. 신경에 있는 캘리포니아2 + 유입 및 캘리포니아2 + 릴리스는 감마-aminobutyric 산 (GABA)A 수용 체 (GABAAR) GABAergic 시 냅 스에서의 클러스터링에 대 한 반대 효과의 저해에 대 한 책임은 신경 흥분3. 캘리포니아2 + 유입 대규모 신경 흥분을 동반 시 냅 스 GABAAR 클러스터의 분산을 유도, 영구 캘리포니아2 + 응급실에서 출시 하는 반면 시 냅 스 GABAARs의 클러스터링을 촉진. 다른 그룹 또한 성장 콘의 튜닝 방향 비판적으로 Ca2 + 신호 소스에 의존은 보고: 캘리포니아2 + 유입 유도 반발, 동안 캘리포니아2 + 릴리스 가이드 신경 성장의 매력 콘4. 따라서, 완벽 하 게 이해 하는 캘리포니아2 + 특정 세포 출력 기본 경로 신호, 그것은 캘리포니아2 + 신호 subcellular 해상도 설명 하 여 캘리포니아2 + 신호 소스를 식별 하는 것이 중요.
이 프로토콜에 우리는 Ca2 + 이미징 메서드를 Ca2 + 신호 Ca2 + 신호 소스 (그림 1)의 평가 허용 한다 subcellular 해상도에 대해 설명 합니다. 바로 아래에 원형질 막 캘리포니아2 + microdomains는 성공적으로 지표에 의해 유전으로 인코딩된 캘리포니아2 + (GECIs) 플라즈마 멤브레인 지역화 신호 Src 내 Lck의 첨부 파일을 통해 플라즈마 멤브레인을 대상으로 모니터링 GECIs5의 N termini에 니. Ca2 + 신호 패턴 더 나은 공간과 시간 해상도 응급실 주변 감지, 우리 최근 개발 OER-GCaMP6f, 어느 GCaMP6f6 대상 응급실 외부 막에서 ER 막 횡단 단백질을 사용 하 여. OER-GCaMP6f 캘리포니아2 + 그리고 GECIs의 확산을 방지 하 여 민감하게 COS-7 셀7 와 HEK293 세포8, 기존의 nontargeted GCaMP6f 보다는 더 나은 spatiotemporal 해상도에 응급실에서 Ca2 + 자료를 보고할 수 있습니다. . 우리는 또한 사이트-GCaMP6f에 의해 보고 된 교양 hippocampal 이다에서 자발적인 Ca2 + 고도 다른 spatiotemporal 패턴을 보여 확인 원형질 막 표적으로 GCaMP6f에 의해 모니터링에 비해 (Lck-GCaMP6f)7 ,9, 나타내는 Lck-GCaMP6f와 함께에서 OER-GCaMP6f와 함께 캘리포니아2 + 이미징 캘리포니아2 + 신호 그들의 소스를 식별 하기 위해 subcellular 해상도 해 부에 기여.
현재, 우리는 캘리포니아2 + 신호 해 부 HeLa 세포와 신경-사이토 혼합 유리 coverslips에 도금 하는 문화에 대 한 프로토콜을 선발. 캘리포니아2 + 이미징 기술은 GECIs와 표시 여기, Lck-GCaMP6f, 플라즈마 막 대상 RCaMP210 (Lck-RCaMP2), 고 OER-GCaMP6f (그림 1) 이러한 GECIs를 표현할 수 있는 모든 셀에 적용 됩니다.
Protocol
여기에 설명 된 모든 실험의 교육, 문화, 스포츠, 과학 및 기술 일본 교육부에 의해 발행 하는 지침에 따라 RIKEN 안전 위원회 동물 실험 위원회에 의해 승인 되었다.
1입니다. 셀의 준비
- 폴 리 (ethyleneimine)의 준비-coverslips 코팅
참고: 그것은 신경 및 그들의 개발을 방지 하지 않고는 coverslips에 단단히 연결할 이다 수로 Poly(ethyleneimine) (페이) 코팅 유리 기구에 대 한 좋습니다. 그러나, 다른 코팅 방법 (ornithine 폴 리, 폴 리 L-리 신, laminin 코팅) 유리 하단 요리에 필요한 경우 사용할 수 있습니다.- 12-잘 접시의 각 음에 18 m m 직경 유리 coverslip를 배치 합니다. 0.04% 페이 솔루션 (12.5 mL/12-잘 접시) 소독된 물을 사용 하 여 준비 합니다.
- 각 우물에 0.04% 페이 솔루션의 1 mL를 추가 합니다. 아래는 coverslips 아무 거품 인지 확인 합니다.
- 37 ° c.에 하룻밤 CO2 인큐베이터에 접시를 품 어
- 다음 날, 세척 3 코팅된 coverslips 멸 균 물의 1 mL x. 흡 인기와 페이 솔루션을 제거 하 고 각 우물을 소독된 물 1 mL를 추가 하는 coverslip 접시 사이 페이 솔루션 철저 하 게 밖으로 세척 될 수 있다 12-잘 접시를 흔들어. 나머지 페이 셀에 대 한 독성으로, 되도록 물 후 최종 세척은 완전히 발음 하 고 있다.
- 건조 하 고 자외선 (UV) 적어도 15 분 동안 빛을 후드 안에 coverslips 소독. 페이 코팅 접시 4 ° C에서 최대 2 개월까지 저장할 수 있습니다. 그냥 사용 하기 전에 15 분 동안 자외선과 요리를 밝히는.
- 문화 매체의 증발을 방지 하기 위해 우물 사이의 공간에 멸 균 증류수 5 mL를 추가 합니다.
- 셀 라인 도금
참고: 이 프로토콜 transfection 포유류 세포 선, HeLa 세포와 COS-7 셀에서에서 셀에 대 한 예를 제공합니다. 사용자가 그들의 실험에 대 한 최적화 된 다른 transfection 프로토콜을 적용할 수 있습니다. 이 섹션에서는, HeLa 세포 문화 프로토콜, COS-7 셀에 적용 됩니다 설명 합니다.- Transfection는 전날에서 그들은 70%-90% 합류 달성 될 때까지 10 cm 배양 접시에 셀 문화.
- 문화 매체를 prewarm ( 테이블의 자료를 참조 하는) 37 ° c
- 2 세포를 씻어 캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 + (PBS [-]) 없이 염 인산 염 버퍼와 x.
- 발음은 PBS(-), 0.5% trypsin ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) 솔루션의 1 mL를 추가 하 고 품 어 90에 대 한 37 ° C에서 셀 s 그들은 둥근 모양 달성 될 때까지.
- 중지는 trypsinization prewarmed 문화 매체의 9 mL를 추가 합니다. 1: 6의 비율로 배양 된 세포를 희석.
- 씨 페이 코팅 coverslips 12-잘 접시에서에 희석된 셀의 1 mL.
- 쥐 또는 마우스 hippocampal 신경-사이토의 혼합 문화의 준비
참고: 섹션 1.3과 1.4 먼저 검토 해야 합니다 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 하 고 관리 및 실험 동물의 사용에 대 한 공식적으로 승인 된 절차를 따라야 합니다. 신경 문화 프로토콜의 순서도 그림 2에 표시 됩니다.- 층 류 흐름 후드 아래 모든 시 약을 준비 합니다. 두 100으로 장소 Dulbecco의 수정된이 글의 중간 (DMEM) mm 요리 (약 20 mL/요리)는 아이스 박스에 있는 문화.
- DMEM과 20mm 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic 산 (HEPES)의 구성된 해 부 매체의 50 mL를 준비 ( 재료의 표참조) 3 개의 60 m m 문화 요리 (약 7 mL/요리)와 8 35 m m로 매체를 분배 하 고 문화 (약 2 mL/접시) 요리. 다른 아이스 박스에 요리를 놓습니다.
- 부 화 염 분 보충 20 mM HEPES ( 재료의 표참조), 행 크 스 균형된 소금 솔루션의 구성된의 50 mL를 준비 하 고 얼음에 15 mL 원뿔 튜브에는 염 분의 8 mL를 배치.
- 최소 필수 매체 (MEM)와 도금 매체와 B-27, 글루타민, 페니실린 스 ( 재료의 표참조) 보충을 준비 합니다. 실내 온도 (20-28 ° C)에서이 매체를 유지 합니다.
- 70% 에탄올과 수술 기구를 소독.
- 유리 항아리 뚜껑 및 isoflurane의 1 mL에에서 종이 타월을 놓습니다. 1 분 동안 증발 isoflurane 하자.
- 1.3.6 단계에 따라 준비 하는 항아리에 임신한 쥐 또는 마우스를 배치 하 고 깊은 마 취 때까지 항아리에 동물을 유지 (약 30 s, 1 분).
- 단지에서 마 취 동물을 70% 에탄올으로 그들을 분사 하 여 동물 해 부 장비를 소독. 표준 해가 위와 핀셋으로 복 부 중간을 잘라 고 임신한 쥐 또는 마우스에서 자 궁을 추출 합니다.
- E18-19 태아 여성 쥐를 마 취 또는 섬세 한 해가 위를 사용 하 여 마우스의 자 궁에서 추출 고 추출한 배아 링 집게와 차가운 마 취에 대 한 10 cm 접시에 얼음 처럼 차가운 DMEM 합니다.
- 잘 해 부가 위 태아 목을 벨과 10 cm 접시에 얼음 처럼 차가운 DMEM에 머리를 놓습니다.
- 13 cm 곡선 Semken 집게와 좋은 팁으로 겸 각 배아에서 뇌를 추출 합니다. 60 mm 접시에 얼음 처럼 차가운 해 부 매체에 뇌를 유지.
- 된, 두 개의 집게를 사용 하 여 35mm 요리에 얼음 처럼 차가운 해 부 매체에서 좋은 팁을 제거 하 고 얼음에 15 mL 원뿔 튜브에 화 염에서 격리 된 조직 유지.
- 화 염으로 된 세척 하 고 품 어 트립 신 (1.25 mg/mL)와 DNase I (0.25 mg/mL) 37 ° c.에 5 분에 대 한 화 염에 권장된 인큐베이션 볼륨은 부 화 염 분, 150 µ L 재고 트립 신, x 20의 주식의 20 x DNase 150 µ L의 2.7 mL ( 재료의 표참조).
- 세척 된 3 x 차가운 화 염.
- 부 화 염 발음 및 DNase를 포함 하는 도금 매체의 1 mL을 추가 내가 (재고 솔루션의 10 µ L, 참조 테이블의 자료). Pipetting 더 이상 20 x 조직을 일시 중지 하 고 셀 카운터와 Trypan 블루 분석 결과 사용 하 여 가능한 셀의 밀도 측정.
- 105 가능한 셀/mL 쥐와 105 가능한 셀/mL 마우스 x 2.5 x 1.4의 밀도 hippocampal 세포를 희석. 1 mL에 페이 코팅 coverslips 12-잘 배양 배지에서 희석된 셀 정지의 씨앗
- 2-3 일 동안 CO2 인큐베이터에서 37 ° C에서 세포를 유지 합니다.
- 도금 매체를 제거 합니다. 세포를 밖으로 건조 하지 마십시오. 빠르고 부드럽게 prewarmed 유지 보수 매체 추가 ( 재료의 표참조).
- 쥐 대뇌 피 질의 신경-사이토의 혼합 문화 및 냉동된 세포 및 냉동 문화 부흥의 준비
참고: 대뇌 피 질 세포의 cryopreservation 방법 설명된 previously11 했다. 여기 있는 대뇌 피 질의 세포 저장할 수 있습니다-80 ° C에서 3 개월 이상 수정된 프로토콜 제공 됩니다. 이 프로토콜에 대 한 순서도 그림 2에 표시 됩니다.- DMEM, 절 개 매체, 화 염, 및 도금 중간 단계 1.3.1–1.3.4, 그리고 재료의 테이블에표시 된 대로 준비 합니다.
- DMEM, 열 비활성화 태아 둔감 한 혈 청, 그리고 페니실린-스 ( 재료의 표참조)의 구성 세척 매체를 준비, 필요한 경우.
- E18-19 태아 여성 쥐를 마 취 또는 섬세 해 부가 위를 사용 하 여 마우스의 자 궁에서 추출 하 고 찬 마 취에 대 한 차가운 DMEM에 각각 추출한 배아를 링 집게를 사용 하 여.
- 배아에서 두뇌를 제거 하 고 차가운 해 부 매체에서 그들을 유지. 에 이르렀다는 제거 하 고 얼음에 15 mL 원뿔 튜브에 화 염에서 그들을 유지 하는 것.
- 부 화 염으로 이르렀다는 세척 하 고 품 어 트립 신 (1.25 mg/mL)와 DNase 이르렀다는 나 (0.25 mg/mL) 37 ° c.에 5 분에 대 한 화 염에 12 이르렀다는 대 한 권장된 인큐베이션 볼륨은 화 염, 재고 트립 신, x 20의 300 µ L 20 x 재고 DNase의 300 µ L의 5.4 mL 나.
- 이르렀다는 3 씻고 차가운 화 염 x.
- 상쾌한을 제거 하 고 도금 매체의 2 mL 보충 DNase의 150 µ L 나 사진 추가. 20 획, pipetting으로 세포 분열 하 고 70 µ m의 기 공 크기와 셀 스 트레이너를 사용 하 여 셀을 필터링 합니다.
- 도금에 대 한 도금 매체의 20 mL와 함께 셀 여과기를 세척. 냉동된 세포의 준비에 대 한 세척 매체의 20 mL로 세포 세척 ( 재료의 표참조)
- 셀 카운터와 Trypan 블루 메서드를 사용 하 여 가능한 셀의 밀도 측정 합니다.
- 105 가능한 셀/mL 도금 매체와 x 1.4의 밀도에 대뇌 피 질의 세포를 희석 하 고 페이 코팅 coverslips 12-잘 배양 배지에서 희석된 셀 서 스 펜 션의 1 mL를 추가할.
- 2-3 일 동안 37 ° c CO2 배양 기에서 세포를 유지 하 고 유지 보수 매체 문화 매체를 변경.
- 1.4.9 단계 후 centrifuging 187 x g 스윙으로 터를 사용 하 여 3 분 동안에 전지 하 여 냉동된 대뇌 피 질의 세포 재고를 준비 합니다.
- 발음은 상쾌한 고 cryopreservation 매체 1 x 107 셀/mL의 셀 밀도를 4 ° C에서 보관 ( 재료의 표참조)을 추가 합니다. 극저온 튜브에 세포 현 탁 액의 aliquot 1 mL.
- 셀-80 ° C의 온도 도달할 때까지 동결 속도-1 ° C/min의 컨테이너를 냉동에 튜브를 놓고-80 ° C 냉장고에 냉동 컨테이너를 전송 합니다. 셀-80 ° c.에 3 개월 이상 저장 될 수 있다
- 냉동된 세포 부활, 세척 매체 (대략 13 mL 각 저온 관) 및 냉동된 대뇌 피 질의 세포 ( 재료의 표참조)에 대 한 유지 보수 매체 prewarm.
- 물 욕조에 37 ° C에서 급속 냉동된 셀 동
- Prewarmed 세척 매체와 부드럽게 해 동된 세포를 희석. 스윙으로 터를 사용 하 여 3 분 동안 187 x g 에서 셀 원심
- 세척 매체의 1 mL에 펠 릿을 일시 중단 하 고 실행 가능한 세포 밀도 측정 한다.
- 105 가능한 셀/mL, 그리고 씨 페이 코팅 12-잘 접시에 셀 서 스 펜 션의 1 mL x 3.0의 셀 밀도 냉동된 대뇌 피 질의 세포에 대 한 유지 보수 매체와 셀을 희석.
2입니다. 막 대상 GECIs의 표현
-
세포의 transfection
- 추가 250 ng GECI 플라스 미드 (즉, Lck-GCaMP6f, Lck-RCaMP2, 또는 OER-CMV 모터와 GCaMP6f)의 감소 된 혈 청 매체의 100 µ L을7,8,9 ( 재료의 표참조) 잘 당. Lck RCaMP2 및 각 우물에 감소 된 혈 청 매체의 100 µ L에서 각 플라스 미드의 사용 250 ng OER GCaMP6f의 cotransfection에 대 한.
- 0.5 µ L transfection 시 약의 추가 ( 재료의 표참조) 플라스 미드 감소 혈 청 매체 혼합물으로 잘 당. Lck RCaMP2 및 OER-GCaMP6f의 cotransfection, 0.5 µ L 당 잘 transfection 시 약의 추가.
- 실내 온도 (20-28 ° C)에서 30 분 동안 혼합물을 품 어.
- Drop-wise 방식으로 각 coverslip에 혼합물의 100 µ L를 추가 합니다.
- GECIs의 식 수를 37 ° C에서 CO2 배양 기에서 48-72 h에 대 한 셀을 품 어.
-
Transfection 그리고 hippocampal 또는 대뇌 피 질의 뉴런의 adeno 관련 바이러스 감염
참고: Transfection 생체 외에서 3-5 일 동안 (DIV) 뉴런에 대 한 높은 transfection 속도에서 발생합니다. 6-8 DIV에서 transfection 이다 GECIs 최적의 표현에 대 한 선호 이다. 표현의 GECIs 천연된 문화 뉴런에 9 DIV 후, adeno 관련 바이러스 (AAV) 벡터의 감염 더 나은 식 효과를 제공합니다. Lck-GCaMP6f, Lck-RCaMP2 및 앞에서 설명한 발기인 준비 했다 EF1a 아래 사이트-GCaMP6f의 표현 위한 AAV 벡터,12 셀 HEK293를 사용 하 여 ( 재료의 표참조).- Transfection 도금 후 3-8 일에 대 한 레이블 2 튜브, 플라스 미드 DNA 및 transfection 시 약에 대 한 다른 합니다.
- 감소 된 혈 청 매체의 50 µ L 추가 ( 재료의 표참조) 각 관을 잘 당.
- 플라스 미드 DNA 튜브를 잘 당 0.5 µ g의 플라스 미드 DNA coverslip 당 및 동반 transfection 시 신경 ( 재료의 표참조)에 대 한 보충의 1 µ L를 추가 합니다. Lck RCaMP2 및 OER-GCaMP6f의 cotransfection에 대 한 각 플라스 미드의 0.5 µ g 및 보충의 1 µ L 당 잘 감소 된 혈 청 매체의 50 µ L에 혼합 됩니다.
- 1 µ L transfection 시 약의 추가 ( 재료의 표참조) transfection 시 튜브에 잘 당. Transfection 시 약 같은 양의 cotransfection 사용 됩니다.
- 두 소용돌이 튜브 1-2에 대 한 합니다.
- (2.2.3 단계)에서 DNA 혼합물에 (에서 단계 2.2.4) transfection 시 혼합물을 추가 합니다. 부드럽게 pipetting으로 혼합 하 고 실 온에서 5 분을 위한 혼합물 (coverslip 당 100 µ L)를 품 어.
- Drop-wise 방식으로 셀에이 혼합물을 로드 합니다.
- 마커 단백질 표현 될 때까지 2-3 일에 대 한 CO2 배양 기에서 세포를 품 어.
- AAV 감염에 대 한 혼합된 신경-사이토 문화를 잘 당 AAV의 3 µ L를 추가 합니다. 요리 락으로 부드럽게 혼합. Lck RCaMP2 및 OER-GCaMP6f의 두 배 감염에 대 한 각 AAV의 3 µ L 당 잘 소개 된다. GECIs를 표현 하는 세포 수가 충분 하지 않습니다, 경우에 감염에 대 한 최적의 AAV 금액을 결정 한다.
- 문화는 GECIs 표현 됩니다 때까지 1-2 주 동안 유지 한다.
3. 캘리포니아2 + 영상
-
Lck RCaMP2 및 사이트 GCaMP6f을 표현 하는 세포의 동시 영상
참고: 동시에 기록 Lck RCaMP2 및 OER GCaMP6f 신호, 광학 이미지 분할가 필요 합니다. 광학은 RCaMP2와 GCaMP6f의 분리 및 카메라 (그림 3A)의 동일한 사진 프레임에 그들의 투영을 사용 합니다. 동시 이미징도 필요 (1) 광원 여기 파랑 (450-490 nm)에 빛을 방출 동시에 수 그린 (500-560 nm) 스펙트럼, (2) 더블-밴드 필터 dichroic 거울 세트, 현미경에 및 (3) 방출 RCaMP2에 대 한 필터 및 GCaMP6f입니다. 자세한 내용은 테이블의 자료를 참조 하십시오.- 이미징 장치 및 컴퓨터 적어도 30 분 녹음 하기 전에 켭니다. 37 ° c 챔버 난방 현미경 prewarm 이미지 분할 장치, 필터 및 광원을 설정 합니다. 보기의 동일한 필드 카메라에 표시 되도록 이미지 분할 광학을 맞춥니다. 적절 한 목표 렌즈 선택 ( 재료의 표참조).
- Lck RCaMP2와 마운트 셀을 포함 하는 coverslip 페 OER-GCaMP6f 녹음 실에서 챔버에 적절 한 영상 매체 또는 버퍼 (18 mm coverslips µ 400 L)를 추가 하 고 현미경 스테이지에 배치 합니다. 매체의 증발을 피하기 위해 녹음 실에는 뚜껑을 놓습니다.
- Lck RCaMP2와 OER-GCaMP6f 형광 영상으로 표현 하는 셀을 찾습니다. Photobleaching 및 phototoxicity를 방지 하기 위해 여기 빛의 강도 최소화 합니다.
- 뚜껑을 제거 하 고 10 Hz에서 시간 경과 녹음을 시작 합니다. 이 녹음 하는 동안 Ca2 + 반응을 (예를 들어, 히 스타 민 HeLa 세포, COS-7 셀에 대 한 ATP에 대 한)을 약 실에는 길 항 제를 추가 합니다.
- 하드 디스크 드라이브 (HDD)에서 시간 경과 데이터를 저장 합니다.
- 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 데이터를 분석 합니다.
-
Lck RCaMP2와 OER-GCaMP6f 이다의 자발적인 활동을 기록
참고: 광학 이미지 분할 수 없이 Ca2 + 원형질 막과 그 주위에 응급실에서 신호는 동일한 셀에 모니터링할 수 있습니다. 여기, 같은 이다 Lck-RCaMP2 및 GCaMP6f OER의 순차 기록 설명 되어 있습니다. 1.3 보다 큰 숫자 조리개와 기름 침수 목표가 자발적인 캘리포니아2 + 활동에 대 한 좋습니다.- 현미경에 설정, 카메라, 광원, 그리고 현미경 난방 챔버 녹음 하기 전에 적어도 30 분.
- Lck RCaMP2와 OER-GCaMP6f 녹음 실에서 transfected 세포를 포함 하는 coverslip 탑재 하 고 영상 매체의 400 µ L를 추가 합니다. 장소는 챔버 위에 뚜껑입니다.
- GCaMP6f 및 광원에 대 한 설정 하는 필터를 선택 하십시오 (여기 빛, 예를 들면 470– 490 블루 nm; 참조 테이블의 자료). OER-GCaMP6f 표현 이다를 찾습니다.
- RCaMP2에 대 한 필터 설정 및 광원 선택 (여기 빛, 예를 들어, 510-560 nm 녹색; 테이블의 자료를 참조) Lck RCaMP2 같은 이다 표현 여부 확인. Photobleaching를 방지 하기 위해 광원에 오래 노출을 하지 마십시오.
- 2 분에 대 한 기록 시간 경과 이미지 Lck-RCaMP2 2 Hz에서의 HDD에 이미지 데이터를 저장합니다.
- GCaMP6f에 대 한 설정 하는 필터를 변경 합니다. 2 분에 대 한 2 Hz에서 같은 필드의 보기에서 사이트 GCaMP6f의 기록 시간 경과 이미지는 하드 디스크에는 데이터를 저장합니다.
- 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 데이터를 분석 합니다.
-
신경에 자발적인 신경 활동과 유도 Ca2 + 상승 기록
참고: 신경 영상에 대 한 현미경 설치는 섹션 3.2에에서 설명 된 것과 동일 합니다. 여기, Lck GCaMP6f 때문에 자발적인 캘리포니아2 + 상승 및 캘리포니아2 + 상승 OER-GCaMP6f 인 mGluR 활성화에 의해 유도 된 이미징 설명 되어 있습니다.- 자연 신경 활동을 기록, 녹음 실에서 Lck-GCaMP6f을 표현 하는 셀을 포함 하는 coverslip 탑재를 영상 매체의 400 µ L를 추가 합니다. 장소는 챔버 위에 뚜껑입니다.
- GCaMP6f에 대 한 필터 및 광원 (파란색 여기, 예: 470-790 nm; 참조 테이블의 재료)를 설정 합니다. Lck GCaMP6f을 표현 하 고 자발적인 활동을 보여주는 뉴런을 찾을.
- 2 Hz에서 또는 더 빠른 이미지를 취득 합니다. 하드 디스크에 있는 데이터를 저장 합니다.
- 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 데이터를 분석 합니다.
- 유도 된 Ca2 + 상승 기록, 탑재 400 OER-GCaMP6f을 표현 하는 셀을 포함 하는 coverslips µ L 영상 매체. 장소는 챔버 위에 뚜껑입니다.
- 필터를 사용 하 여 GCaMP6f에 대 한 설정, 사이트 GCaMP6f을 표현 하는 뉴런을 찾을.
- 뚜껑을 제거 합니다. 시간 경과 기록 2 Hz에서 또는 더 빨리 시작 합니다. 녹음을 하는 동안 Gq 단백질 결합 된 수용 체에 대 한 agonists를 추가 (예: mGluR5 주 작동 근 [RS]-3, 5-dihydroxyphenylglycine [DHPG]) 응급실에서 Ca2 + 릴리스를 연상.
- HDD에 시간 경과 이미지를 저장 하 고 데이터를 분석.
Representative Results
Lck-RCaMP2 및 GCaMP6f OER HeLa 세포에 표현 했다 고 두 신호가 동시에 이미지 분할 광학, transfection (그림 3A 및 비디오 1) 후 24 h를 사용 하 여 기록 되었다. 이미지 10 Hz. 히 스타 민 (그의 1 µ M), 캘리포니아2 + 출시는 응급실에서 유도, 녹음 하는 동안 추가 되었다에 취득 했다. 그의 응용 프로그램에 따라 Lck RCaMP2 및 OER-GCaMP6f의 신호 강도 증가, δ/F0, 초기 형광 강도 (그림 3B)에서 변화를 나타내는 모조 색상 표시에 의해 표시 된 것 처럼. 캘리포니아2 + 상승 (δ/F0)의 시간 과정 보고 Lck-RCaMP2 및 GCaMP6f OER (ROI) (그림 3C)의 같은 지역에 비교 되었다. Δ/F0 값 그들의 피크 값을 다른 식 수준 및 분포는 두 개의 다른 GECIs 사이 시간 과정 비교로 정규화 되었다. 두 센서 발진 같은 Ca2 + 고도 보고. Lck RCaMP2 및 OER-GCaMP6f 5 셀 종류 중에서 두 개의 셀에 캘리포니아2 + 상승에 대 한 동일한 시간 과정을 보여주었다 (그림 3C, 투자 수익 1 및 3)을 검사 합니다. 그러나, 캘리포니아2 + 고도 Lck-RCaMP2에 의해 표시 된 OER-GCaMP6f (그림 3 C, 2, 4, 및 5 ROI) 표시에 비해 더 높은 수준에 남아 있었다. 결과 종료 이전 응급실, 주위는 그의 자극에 의해 유도 된이 Ca2 + 신호 소스 동안 Ca2 + 상승 원형질 막 주변 장기를 나타냅니다.
자연 스러운 캘리포니아2 + 쥐 된 (그림 4A)에서 문화 혼합 신경 사이토에 이다에서 신호 및 이르렀다는 (그림 4B) Lck RCaMP2 및 OER-GCaMP6f (그림 4, 비디오 2, 비디오 3에 의해 보였다 , 동영상 4, 및 비디오 5). 대뇌 피 질의 문화는이 프로토콜에 설명 된 대로 준비 된 냉동된 주식에서 부활 했다. Lck RCaMP2 및 OER GCaMP6f 신호는 동일한 셀에서 2 Hz에서 순차적으로 기록 되었다. 3 ROIs 각 GECI, 캘리포니아2 + 고도 지역에 선정 됐다 고 δ/F기본 (즉, 형광 강도)의 시간 과정 (F기본 전체 녹음 기간 동안 평균 형광 강도 변경 ). 초기 형광 안정적 이며 캘리포니아2 + 고도 보다 적게 빈번한, F기본 Ca2 + 상승 이벤트를 감지 하는 유용한 기준 된다. 자연 스러운 캘리포니아2 + 고도 astrocytic 과정에서 세포 체에서 볼 수 있었다. 이 결과 astrocytic 자발적인 Ca2 + 신호 다른 GECIs 시각화 된 생체 외에서13 그리고 vivo에서14에 의해 이전 보고서와 일치. Hippocampal와 대뇌 피 질의 이다에서 캘리포니아2 + 고도 Lck-RCaMP2 (위)에 의해 표시 된 사이트-GCaMP6f에 의해 표시 된 것 보다 더 자주 했다. 이 결과 Lck GCaMP6f 때문 이다에서 캘리포니아2 + 고도 OER GCaMP6f7 때문에 그들 보다 더 자주 검색 된 우리의 이전 데모와 일치 하 고이 개념은 또한에서 적용 된 단일 셀 수준입니다.
자발적인 캘리포니아2 + 고도 Lck-GCaMP6f에 의해 미 성숙한 쥐 hippocampal 신경 (10 DIV)에서 2 Hz (그림 5A 및 비디오 6)에서 볼 수 있었다. 5 다른 ROIs에 δ/F0의 시간 과정 캘리포니아2 + 도 이러한 subcellular 도메인에 국한 로컬로 것이 좋습니다. 그림 5B (비디오 7) Ca2 + 응답 성숙한 마우스 hippocampal 신경 (30 DIV)에 감염 된 사이트-GCaMP6f-식 AAV 벡터를 보여준다. 신경 세포는 100 µ M는 주 작동 근 metabotropic 글루타민 산 염 수용 체에 대 한 유도 하는 캘리포니아2 + 버전은 DHPG으로 자극 했다. DHPG 유도 캘리포니아2 + 릴리스 OER-GCaMP6f로 검색 되었습니다.
그림 1: 막 대상 GECIs를 보여주는 다이어그램. 원형질 막 대상 GECIs (Lck-GCaMP6f 및 RCaMP2 Lck) 및 외부 응급실의 회로도 막 대상 GCaMP6f (OER-GCaMP6f).
그림 2: hippocampal 및 대뇌 피 질의 세포 준비, 플라스 미드 transfection 그리고 AAV 감염에 대 한 순서도. 미세한 이미지는 대표, 갓 도금된 DIV 6 대뇌 피 질의 세포 (왼쪽) 및 냉동된 주식 (오른쪽)에서 세포를 부활. 눈금 막대 = 100 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: Lck RCaMP2 그리고 HeLa 세포에 OER-GCaMP6f의 동시 이미징의 예. (A) 이미지 분할 광학 신호 분리의 도식 적인 표현입니다. Lck RCaMP2 및 사이트-GCaMP6f에 대 한 보기의 동일한 필드 카메라에 동시에 예상 된다. CMOS 카메라 10 Hz에서 인수 대표 녹음 비디오 1, 제공 되 고이 녹음의 한 프레임 (오른쪽) 패널 A 에 표시 됩니다. (B) δ/F0 Lck-GCaMP2 (맨 위) 및 사이트-GCaMP6f (아래)의 의사 컬러 이미지. (그의 1 µ M) 히 스타 민 Lck-GCaMP2 (마젠타색) 및 사이트-GCaMP6f (녹색)의 정규화 된 δ/F0 시간 과정 0 미 (C) 대표에 추가 되었습니다. 데이터는 각 플롯에 대 한 최대 δ/F0 값으로 정규화 되었다. 회색 막대는 그의 응용 프로그램의 타이밍을 나타냅니다. 데이터 맞춤 소프트웨어 TI 작업 대15로 분석 되었다. 눈금 막대 = 50 µ m (미세한 이미지). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 자연 스러운 캘리포니아2 + 상승 Lck RCaMP2 및 OER GCaMP6f 식에 대 한 모니터링 이다에서. (A) 대표 hippocampal 고 Lck-RCaMP2 (맨 위)와 OER-GCaMP6f (아래) 페 (B) 피 질 이다. 대뇌 피 질의 세포 냉동된 주식 문화에서 부활 했다. Lck RCaMP2 및 OER GCaMP6f 이미지 순차적으로 동일한 셀, 2 Hz, EM-CCD 카메라와 함께 인수 했다. 왼쪽된 표시는 ROIs δ/Fbase의 시간 과정 측정에 플롯 현미경 이미지에 표시 된. 데이터는 TI 워크 벤치로 분석 되었다. 실제 영화 비디오 2 동영상 3 동영상 4, 비디오 5에서 제공 됩니다. 눈금 막대 = 20 µ m (미세한 이미지). 베이스 라인 드리프트 셀의 글로벌 Ca2 + 수준에서 변경 내용을 제안합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
OER-GCaMP6f Lck GCaMP6f와 신경에 캘리포니아2 + 영상의 그림 5: 예. (A) 대표 쥐 hippocampal 신경 Lck-GCaMP6f 사업부 10 (왼쪽)와 플롯 (오른쪽) 이미지에 δ/F0 ROIs (노란색 동그라미)에 측정의 과정 표시 된 시간을 보여주는 표현 시간 과정에 있는 숫자는 이미지에 투자 수익 번호에 해당합니다. 캘리포니아2 + 상승의 시간적 패턴은 관심의 다양 한 지역 중 다른 note. 베이스 라인 드리프트가이 신경의 글로벌 Ca2 + 수준에 증가 제안합니다. (B) 성숙한 마우스 hippocampal 신경 (DIV 30) OER GCaMP6f 식 AAV 벡터 (왼쪽)와 감염의 예. Δ/F0 측정의 과정 플롯 보여주는 100 μ m Ca2 + 응답 시간 (RS)-3, 5-dihydroxyphenylglycine (DHPG) 회색 막대로 표시 된 타이밍에 적용. 노란 동그라미 시간 코스를 얻어 ROIs의 위치를 표시 합니다. 이미지 냉각 CCD 카메라 (패널 A) 또는 EM-CCD 카메라 (패널 B) 2 Hz에 인수 되었고 티 워크 벤치와 분석. 눈금 막대 = 20 µ m (미세한 이미지). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
비디오 1: Lck RCaMP2 그리고 HeLa 세포에 OER-GCaMP6f의 동시 이미징의 예. 대표적인 녹음 10 Hz에서 취득 하 고 그림 3에 제시. 눈금 막대 = 50 µ m. 이 비디오를 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
비디오 2: 자연 스러운 캘리포니아2 + 과도 관찰 Lck RCaMP2 hippocampal 사이토에. 2 Hz (그림 4A)에서 인수 하는 대표적인 녹음 비디오3 보기의 동일한 필드에 기록. 눈금 막대 = 20 µ m. 이 비디오를 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
비디오 3: 자발적인 캘리포니아2 + 과도 관찰 OER GCaMP6f hippocampal 사이토에. 대표 녹화 비디오 2로 보기의 동일한 필드에 2 Hz (그림 4A)에서 인수. 눈금 막대 = 20 µ m. 이 비디오를 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
비디오 4: 대뇌 피 질의 사이토에 Lck-RCaMP2에서 자발적인 캘리포니아2 + 과도 관찰 2 Hz (그림 4B)에서 인수 하는 대표적인 녹음 비디오5 보기의 동일한 필드에 기록. 눈금 막대 = 20 µ m. 이 비디오를 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
비디오 5: 대뇌 피 질의 사이토에 OER-GCaMP6f에서 자발적인 캘리포니아2 + 과도 관찰. 대표 녹화 비디오4 보기의 동일한 필드에 2 Hz (그림 4B)에서 인수. 눈금 막대 = 20 µ m. 이 비디오를 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
Lck-GCaMP6f에 의해 쥐 hippocampal 신경 (DIV 10)에 캘리포니아2 + 영상의 비디오 6: 예. 신경 캘리포니아2 + 의 예 2 Hz (그림 5A)에 기록 된 신호. 눈금 막대 = 20 µ m. 이 비디오를 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
비디오 7: 캘리포니아2 + 릴리스 마우스 hippocampal 신경 (DIV 30) 표현 OER-GCaMP6f. 신경 캘리포니아2 + 신호 예제 사이트 GCaMP6f 식 AAV 벡터 (그림 5B)와 감염 마우스 hippocampal 신경에 기록. 30에 있는 100 µ M dihydroxyphenylglycine (DHPG)으로 신경 자극 했다 캘리포니아2 + 출시는 응급실에서 연상 s. 눈금 막대 = 20 µ m. 이 비디오를 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
다양 한 생물 학적 출력 캘리포니아2 + 신호에 의해 시작 됩니다. 캘리포니아2 + 다양 한 세포내 신호 메신저입니다. 근본적인 생물학 질문 되었습니다 특정 출력 연상 캘리포니아2 + 신호 디코딩 그리고 캘리포니아2 + 이미징 기술을 캘리포니아2 + 신호의 다양성을 설명 하기 위해 필요 합니다. 현재 상세한 프로토콜 고유 Ca2 + 원형질 막 및 응급실 (그림 3 및 그림 4)와 로컬 Ca2 + microdomains (그림 4 및 그림 5) 셀 내에서 신호 감지 수 있습니다. 이 세포내 캘리포니아2 + 신호의 다양성을 설명 하는에 공헌 한다. 캘리포니아2 + 의 시간적 해상도 또한 캘리포니아2 + 그리고 GECIs,의 3 차원 확산의 효과 피할 수 있고 그것이 검출 가능성이 있기 때문에 원형질 막에 응급실 GECIs를 대상으로 개량 되었다 신호는 캘리포니아2 + 유입 또는 캘리포니아2 + , 막에 발생 하는의 아주 순간.
프로토콜에는 몇 가지 제한이 있습니다. 사용자가 검색 된 신호는 "캘리포니아2 + 유입 또는 릴리스 순간"의 합계 염두에 두어야 할 "캘리포니아2 + 확산 밖으로 캘리포니아2 + 원본에서", 특히 큰 캘리포니아2 + 신호에 대 한 및. 예를 들어 비록 HeLa 세포에서 그의 자극 끝 캘리포니아2 + 릴리스 응급실, ER 대상 사이트-GCaMP6f에 의해 뿐만 아니라 플라즈마 막 대상 Lck-RCaMP2 (그림 3)에 의해2 + 신호 감지의 결과 Ca에서. 또 다른 한계는 캘리포니아2 + 신호 spatiotemporal 패턴 캘리포니아2 + 신호 출력의 유일한 결정 요인이 되지 않을 수 있습니다. 다운스트림 effector 단백질의 분포 (Ca2 +같은-종속 kinases와 가수분해)2요소를 결정할 수도 있습니다. 완전히 세포내 캘리포니아2 + 신호 디코딩,이 프로토콜에 적용 되지 않습니다, 다운스트림 효소 행동의 분석은 절대적으로 필요 하다.
성공적인 캘리포니아2 + 이미징에 대 한 가장 중요 한 측면 중 하나는 이미지 설정 및 이미지 인수 조건, 뿐만 아니라 다른 라이브 이미징 연구에 관해서는. 우리는 이전 캘리포니아2 + 응답 셀에는 높게 지 기간 및 흥분의 강도에 노출 시간 및 수집 주파수16를 포함 한 이미지 획득 조건에 보였다. 조명 전원을 광 독성 및 photobleaching GECIs의 발생할 수 있습니다 가장 중요 한 요소입니다. 노출 시간, 주파수, 흥분 빛의 강도, 및 기간 기록의 기록의 기록 조건 실험의 목적에 따라 최적화 되어야 합니다. 노출 시간 및 흥분 빛의 강도 photobleaching와 phototoxicity 셀을 피하기 위해 가능한 한 많이 감소 하는 것이 좋습니다. 녹음 주파수와 녹음 기간 Ca2 + 상승 이벤트 관심을 커버 하기에 충분 해야 하지만 또한 photobleaching 및 phototoxicity을 피하기 위해 가능한 한 낮게 유지 되어야 한다. 먼저 녹음 주파수와 기간을 결정 하 고는 GECIs photobleaching 최소화 되도록 노출 시간과 빛의 강도 최적화는 것이 좋습니다. 또 다른 중요 한 요소는 GECIs 식 수준입니다. GECIs는 캘리포니아2 +-그들은 캘리포니아2 +효과 버퍼링-바인딩 단백질. 따라서, GECIs의 overexpression 셀에 대 한 생리 적으로 필요한의 캘리포니아2 +, 버퍼링 발생 합니다. GECI 식의 양은 GECIs의 높은 금액을 표현 하는 이미징 셀을 피하기 위해 최소화 한다.
결론적으로, 캘리포니아2 + 신호 subcellular 해상도 해 부 세포내 캘리포니아2 + 출력 생물 학적 현상을 결정 하는 신호를 해독 하는 가장 중요 한 단계 중 하나입니다. 이 프로토콜의 이러한 신호 중 다양성을 설명 하기 위해 캘리포니아2 + 신호 해 부에 대 한 새로운 방법을 제공 합니다. 현재,이 기술은 체 외 실험에 대 한 제한 됩니다. 그러나, Lck-GCaMP6f 이미 쥐17, vivo에서 캘리포니아2 + 이미징에 사용 되 고 그리고 OER GCaMP6f 모니터링 Ca2 + C. 선 충7에서에서 VD 모터 뉴런에 생체 신호 확인 했다. 따라서, subcellular 격실에 있는 GECIs를 타겟팅 vivo에서 이미징 미래에, 따라서 사용 하면 Ca2 + vivo에서 해 부에 확장 될 가능성이 있다.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 다음 교부 금에 의해 지원: 일본 과학 및 기술 기관 (JST) / Precursory 연구 배아 과학 및 기술 (프레스 토) (JPMJPR15F8, 일본); 과학 (JSP)의 승진을 위한 일본 사회 / 다케다 기초 과학 연구 (KAKENHI) (JP18H05414, JP17H05710, JP16K07316)에 대 한 원조에 부여. 저자 RCaMP2 및 아서 재 황 제공 Haruhiko Bito (도쿄 대학)를 감사 하 고 토마스 맥 휴 (RIKEN CBS) AAV 벡터를 제공 하 고 대 한 지침은 AAV 준비에 관한. 저자는 또한 편집자 저널의 시각 실험 비디오 촬영 및 편집 그들의 도움에 감사 하 고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (RS)-3,5-Dihydroxyphenylglycine (DHPG) | Tocris | #0342 | |
| 0.5% DNase I stock solution | Sigma-Aldrich | #11284932001 | Prepare 0.5% DNase I (w/v) in Hanks' Balanced Salt Solution supplemented with 120 mM MgSO4. Prepare 160 µL aliquots and store at -30 °C. |
| 0.5% Trypsin-EDTA solution | Thermo Fisher Scientific | #25300054 | |
| 100 mM L-glutamine (×100 stock) | Thermo Fisher Scientific | #25030081 | Preparing small aliquots of 250-750 µL and store at -30 °C. |
| 100 mM Sodium pyruvate (×100 stock) | Thermo Fisher Scientific | #11360070 | Aliquots (10 mL) can be stored at -20 °C. After thawing, the solution can be maintained at 4 °C for 2 months. |
| 12-Well multiwell culture plates with low-evaporation lid | Falcon | #353043 | Low-evaporation lid is critical for culturing neuron-glia mixed culture. For cell line cells, alternative culture dishes can be used. |
| 18 mm diameter circular coverslips | Karl Hecht "Assistent" | #41001118 | Thickness 1, 18 mm diameter circular coverslips; alternative coverslips can be used. |
| 1 M HEPES | Thermo Fisher Scientific | #15630080 | pH 7.2-7.6 |
| 2.5% Trypsin stock solution (×20 stock) | Sigma-Aldrich | #T4674 | Prepare 150 µL aliquot and store at -30 °C. |
| 50% Poly(ethyleneimine) (PEI) solution | Sigma-Aldrich | #P3143 | Prepare 2% (V/V) PEI stock solution (×50) with distilled water sterilized by filtration. Store stock solution at -30 °C after preparing small aliquots of 250-750 µL. Prepare 0.04% PEI solution with distilled water on the day of coverslip coating. |
| 70% Ethanol | Kept in a spray bottle to be used for surface disinfection. | ||
| Adeno-associated virus (AAV) for Lck-GCaMP6f, Lck-RCaMP2, and OER-RCaMP2 expression under the direction of the EF1a promoter | AAV can be prepared using AAV Helper Free System (Agilent Technologies) and HEK293 cells, or alternative methods. pAAV.EF1a.Lck-GCaMP6f, pAAV.EF1a.Lck-RCaMP2, and pAAV.EF1a.OER-GCaMP6f are available upon request. | ||
| B-27 supplement (×50 stock) | Thermo Fisher Scientific | #17504044 | This can be replaced by B-27 plus supplement (Thermo Fisher Scientific; #A3582801) or MACS NeuroBrew-21 (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany; #130-093-566). |
| B57BL/6 | Japan SLC, Inc. | ||
| Camera for microscopic image recording | The following cameras were available for use: cooled-CCD camera (e.g., Hamamatsu Photonics, OECA-ER), EM-CCD camera (e.g., Hamamatsu Photonics, ImagEM; Andor, iXon) or CMOS camera (e.g., Hamamatsu Photonics ORCA-Flash4.0) | ||
| Cell freezing container | Sarstedt K.K. | #95.64.253 | Alternative cell freezing container can be used. |
| Cell strainer | Falcon | #352350 | |
| CO2 incubator | Maintain at 37 °C, 5% CO2. | ||
| Cryogenic tube | Corning | #430661 | Alternative cryogenic tubes can be used. |
| Cryopreservation medium | Zenoaq | "CELLBANKER1" | |
| Culture medium (for HeLa cells) | Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) supplemented with 10% heat-inactivated fetal bovine serum, and penicillin-streptomycin solution (final concentration: Penicillin 100 U/mL and Streptomycin 100 µg/mL) | ||
| Dissection medium | One milliliter of 1 M HEPES (final concentration 20 mM) to 49 mL DMEM | ||
| DMEM | Nacalai | #08456-65 | Alternative DMEM can be used. |
| DMEM | Nacalai | #08456-65 | Low glucose |
| DNA transfection reagent | Sigma-Aldrich | #6366244001 | "X-tremegene HP DNA transfection reagent" Alternative transfection reagents can be used. |
| Glass jar with a lid | 500 mL jar (for mouse) or 1,500 mL jar (for rat) to anesthetize the animal | ||
| HBSS | Thermo Fisher Scientific | #14170161 | HBSS free of calcium and magnesium |
| Heat inactivated bovine serum | Thermo Fisher Scientific | #10100147 | |
| HeLa cells | RIKEN BioResource Center | #RCB0007 | |
| Histamine | Sigma-Aldrich | #H7125 | |
| Image analysis software | Such as Metamorph (Molecular Devices), ImageJ (NIH), and TI Workbench14 (custom made) | ||
| Image splitting optics | Hamamatsu Photonics | #A12801-01 | W-view GEMINI |
| Image splitting optics dichroic mirror | Semrock | #FF560-FDi01-25×36 | For separation of green fluorescent protein/red fluorescent protein (GFP/RFP) signal |
| Image splitting optics emission filters | Semrock | #FF01-512/25-25, #FF01-630/92-25 | For emission of GFP/RFP signal, respectively |
| Imaging medium and buffer | Use optimal medium or buffer for the experiment. When medium is used, medium without phenol red is desirable to reduce background fluorescence. Add 20 mM HEPES to maintain pH outside of CO2 incubator. | ||
| Incubation saline | Add 1 mL of 1 M HEPES (20 mM) to 49 mL HBSS | ||
| Inverted fluorescence microscope | Such as IX73 (Olympus) or Eclipse TI (Nikon Instech) | ||
| Isoflurane | Pfizer | Used for anesthesia | |
| Maintenance medium (for 4 × 12 well dishes) | 48.5 mL Neurobasal-A medium supplemented with 1 mL B-27, 500 µL of L-glutamine stock and 25 µL Penicillin-Streptomycin solution. | ||
| Maintenance medium for frozen cortical cells (for 1 × 12 well dishes) | 12.2 mL Neurobasal plus medium supplemented with 250 µL B-27, 125 µL of L-glutamine stock and 6.2 µL Penicillin-Streptomycin solution. | ||
| MEM (Minimum Essential Medium) | Thermo Fisher Scientific | #11090-081 | |
| Microscope filter set for GCaMP6f imaging | Appropriate filter for GFP (excitation, 480 ± 10 nm; emission, 530 ± 20 nm) | ||
| Microscope filter set for RCaMP2 imaging | Appropriate filter for RFP (excitation, 535 ± 50 nm; emission, 590 nm long pass) | ||
| Microscope filter sets for double imaging of RCaMP2 and GCaMP6f | Semrock | #FF01-468/553-25, #FF493/574-FDi01-25×36, #FF01-512/630-25 | Dual excitation filter, Dual dichroic mirror, and emission filter for GFP/RFP imaging. |
| Microscope heating system | A heating system to maintain cells at 37 °C during the imaging. To avoid drift caused by thermal expansion, heating systems covering the entire microscope itself (e.g., Tokai Hit, Thermobox) are recommended. | ||
| Microscope light source for excitation | Mercury lamp (100 W), xenon lamp (75 W), Light-emitting diode (LED) illumination system (e.g., CoolLED Ltd., precisExcite; Thorlabs Inc., 4-Wavelength LED Source; Lumencor, SPECTRA X light engine). In case of mercury lump and xenon lamp, use ND filter to reduce the excitation intensity. | ||
| Microscope objective lens | Plan-Apochromat oil immersion objective with numerical aperture higher than 1.3 is highly recommended for the recording of spontaneous Ca2+ activity in neurons and astrocytes. | ||
| Neurobasal plus medium | Thermo Fisher Scientific | #A3582901 | |
| Neurobasal-A Medium | Thermo Fisher Scientific | #10888022 | Neurobasal plus medium (Thermo Fisher, A3582901) can be used instead of Neurobasal-A medium. |
| PBS(-): Phosphate-buffered saline free of Ca2+ and Mg2+ | Fujifilm Wako Pure Chemical Cooperation | #164-23551 | The absence of Ca2+ and Mg2+ is critical not to inhibit the trypsin activity. An alternative to PBS(-) can be used. |
| PC and image acquisition software | Such as Metamorph (Molecular Devices); Micromanager; TI Workbench14. | ||
| Penicillin-Streptomycin solution | Thermo Fisher Scientific | #15140122 | Penicillin 10,000 U/mL and Streptomycin 10,000 µg/mL |
| Plasmid for Lck-GCaMP6f, Lck-RCaMP2, and OER-RCaMP2 expression under cytomegalovirus promoter 7-9 | Available upon request | ||
| Plating medium (for 4 × 12 well dishes) | 48 mL MEM supplemented with 1 mL B-27 supplement, 500 µL L-glutamine stock (final concentration: 2 mM), 500 µL of sodium pyruvate stock (1 mM) and 25 µL Penicillin-Streptomycin solution (penicillin 5 U/mL, streptomycin 5 µg/mL). This concentration of Penicillin-Streptomycin, which is 1/20 of the concentration recommended by the manufacturer, is critical for neuronal survival. | ||
| Recording chamber | Elveflow | Ludin Chamber | This recording chamber is for 18 mm diameter round coverslips. |
| Reduced serum media | Thermo Fisher | #11058021 | Opti-MEM |
| Stereomicroscope | Used to dissect hippocampi. Olympus SZ60 or equivalent stereomicroscopes are available. | ||
| Surgical instruments | Standard dissecting scissors to cut the abdomen of a mouse or a rat, tweezers to pinch the uterus, delicate dissecting scissors to cut the uterus and the head of embryo, ring forceps to pinch the embryos, 13 cm curved Semken forceps (Fine Science Tools #11009-13) to extract brains, 3 forceps with fine tips (Dumont Inox #5) | ||
| Transfection reagent for neuron | Thermo Fisher Scientific | #L3000008 | "Lipofectamine 3000" reagent. It is composed of the the "supplement (P3000)" that should be mixed with plasmid DNA in the step 2.2.3, and the "transfection reagent (lipofectamine 3000)" used in the step 2.2.4. |
| Trypan blue (0.4%) | Thermo Fisher Scientific | #15250061 | |
| Wash medium for frozen cortical cells | 25 mL DMEM, supplemented with 250 µL heat-inactivated fetal bovine serum + 12.5 µL Penicillin Streptomycin. | ||
| Wistar rats | Japan SLC, Inc | Pregnant rats (E18) |
References
- Clapham, D. E.
- Bagur, R., Hajnoczky, G. Intracellular Ca(2+) Sensing: Its Role in Calcium Homeostasis and Signaling. Molecular Cell. 66 (6), 780-788 (2017).
- Bannai, H., et al. Bidirectional Control of Synaptic GABAAR Clustering by Glutamate and Calcium. Cell Reports. 13 (12), 2768-2780 (2015).
- Tojima, T., Hines, J. H., Henley, J. R., Kamiguchi, H. Second messengers and membrane trafficking direct and organize growth cone steering. Nature Reviews Neuroscience. 12 (4), 191-203 (2011).
- Shigetomi, E., Kracun, S., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. A genetically targeted optical sensor to monitor calcium signals in astrocyte processes. Nature Neuroscience. 13 (6), 759-766 (2010).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Niwa, F., et al. Dissection of local Ca(2+) signals inside cytosol by ER-targeted Ca(2+) indicator. Biochemical and Biophysical Research Communications. 479 (1), 67-73 (2016).
- Vervliet, T., et al. Basal ryanodine receptor activity suppresses autophagic flux. Biochemical Pharmacology. 132, 133-142 (2017).
- Sakuragi, S., Niwa, F., Oda, Y., Mikoshiba, K., Bannai, H. Astroglial Ca2+ signaling is generated by the coordination of IP3R and store-operated Ca2+ channels. Biochemical and Biophysical Research Communications. 486 (4), 879-885 (2017).
- Inoue, M., et al. Rational design of a high-affinity, fast, red calcium indicator R-CaMP2. Nature Methods. 12 (1), 64-70 (2015).
- Quasthoff, K., et al. Freshly frozen E18 rat cortical cells can generate functional neural networks after standard cryopreservation and thawing procedures. Cytotechnology. 67 (3), 419-426 (2015).
- Boehringer, R., et al. Chronic Loss of CA2 Transmission Leads to Hippocampal Hyperexcitability. Neuron. 94 (3), 642-655 (2017).
- Arizono, M., et al. Receptor-selective diffusion barrier enhances sensitivity of astrocytic processes to metabotropic glutamate receptor stimulation. Science Signaling. 5 (218), ra27 (2012).
- Kanemaru, K., et al. In vivo visualization of subtle, transient, and local activity of astrocytes using an ultrasensitive Ca(2+) indicator. Cell Reports. 8 (1), 311-318 (2014).
- Inoue, T. TI Workbench, an integrated software package for electrophysiology and imaging. Microscopy (Oxford, UK). 67 (3), 129-143 (2018).
- Miyamoto, A., Bannai, H., Michikawa, T., Mikoshiba, K. Optimal microscopic systems for long-term imaging of intracellular calcium using a ratiometric genetically-encoded calcium indicator. Biochemical and Biophysical Research Communications. 434 (2), 252-257 (2013).
- Srinivasan, R., et al. New Transgenic Mouse Lines for Selectively Targeting Astrocytes and Studying Calcium Signals in Astrocyte Processes In Situ and In Vivo. Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).
