Summary
Det er ofte nødvendig å vurdere den potensielle cytotoksisitet av et sett med forbindelser på kulturperler celler. Her beskriver vi en strategi for pålitelig skjerm for giftige forbindelser i et 96-brønn format.
Abstract
Cytotoksisitet er en kritisk parameter som må kvantifisert når man studerer medikamenter som kan ha terapeutiske fordeler. På grunn av dette, mange narkotika screening analyser utnytte cytotoksisitet som en av de kritiske egenskaper for å bli profilert for individuelle forbindelser. Celler i kultur er en nyttig modell for å vurdere cytotoksisitet før du fortsetter å følge opp lovende bly forbindelser i mer kostbare og arbeidsintensive dyremodeller. Vi beskriver en strategi for å identifisere forbindelser som påvirker cellevekst i en tdTomato uttrykker menneskelige nevrale stamceller (NSC) linje. Strategien bruker to komplementære analyser for å vurdere celle nummer. En analysen fungerer via reduksjon av 3-(4, 5-dimethylthizol-2-YL)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) til formazan som en proxy for celle nummer og den andre direkte teller tdTomato uttrykker NSCs. De to analysene kan utføres samtidig i et enkelt eksperiment, og er ikke arbeidsintensive, raske og rimelige. Strategien beskrevet i denne demonstrasjonen testet 57 forbindelser i en undersøkende primærskjerm for toksisitet i en 96-brønn plateformat. Tre av treffene ble preget videre i en seks-punkts dose respons ved hjelp av samme analysen satt opp som den primære skjermen. I tillegg til å gi utmerket bekreftelse for toksisitet, kan sammenligning av resultater fra de to analysene være effektive i å identifisere forbindelser som påvirker andre aspekter av cellevekst.
Introduction
En av de viktigste egenskapene som må fastsettes for en kjemisk forbindelse som har terapeutisk potensial er dens toksisitet for dyreceller. Dette karakteristiske vil avgjøre om et medikament er en god kandidat for mer omfattende studier. I de fleste tilfeller er forbindelser med minimal toksisitet søkt, men det finnes situasjoner der en forbindelse med kapasitet til å drepe bestemte celletyper er av interesse, for eksempel, anti-tumorigene narkotika. Selv om hele dyr er den beste modellen systemer for å fastslå systemisk toksisitet, er kostnaden og arbeidskraft involvert uoverkommelige når mer enn noen få forbindelser må testes. Som sådan er pattedyr cellekultur vanligvis brukt som den mest effektive alternativ1,2. Små til middels gjennomstrømning narkotika skjermer er en viktig modalitet som toksisitet kan vurderes i cellekultur. Disse skjermene kan brukes til å forhøre kommenterte biblioteker rettet mot individuelle signal veier. Den generelle formatet på en slik skjerm er å først teste alle forbindelsene i biblioteket på en enkelt dose (vanligvis 10 μM) i en undersøkende primær toksisitet skjermen, og deretter utføre en grundig sekundær dose respons skjermen for fullt karakterisere toksisitet profilen til treff fra hovedskjermen. Metodene for å implementere denne strategien vil bli beskrevet her og gi en rask, effektiv og rimelig måte å identifisere og karakterisere giftige forbindelser.
Flere metoder er utviklet for å vurdere cytotoksisitet av små forbindelser og nanomaterialebasert i pattedyrceller3,4. Det bør bemerkes at visse materialer kan samhandle med analysen gir villedende resultater, og slike interaksjoner bør testes når karakteriserer treff fra toksisitet skjermer4. Cytotoksisitet analyser inkluderer trypan Blue eksklusjon5, melkesyre DEHYDROGENASE (LDH) Release analysen6, Alamar blå analysen7, calcien acetoxymethyl Ester (am)8, og ATP-analysen9. Alle disse analysene måle ulike aspekter av celle metabolisme som kan tjene som en proxy for celle nummer. Mens alle tilbyr fordeler, tetrazolium salt-baserte analyser som 3-(4, 5-dimethylthizol-2-YL)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), 2, 3-BIS (2-metoksy-4-Nitro-5-sulfopheny)-2H-tetrazolium-5-carboxyanilide indre salt (XTT)-1 og 4-(3-[4- Iodophenyl]-2-[4-nitrophenyl]-2H-5-tetrazolio)-1, 3-benzen disulfonate (WST-1)10,11 gir god nøyaktighet og brukervennlighet til lave kostnader. MTT, som vil bli brukt i denne demonstrasjonen, er redusert til et uløselig formazan av en mitokondrie reduktase og frekvensen av denne konverteringen samsvarer sterkt med celle nummer. Denne analysen har vært rutinemessig utnyttet både i liten skala og for screening biblioteker med opptil 2 000 forbindelser12. Direkte telling av celler med en merket markør tilbyr en annen metode for å vurdere mobilnummeret, og i motsetning til MTT-analysen kan det gi ytterligere informasjon om dynamikken i mobilnettet vekst. Flere offentlig tilgjengelige algoritmer er tilgjengelige for å utføre automatiserte celle tellings analyser, og det finnes også proprietære algoritmer som er en del av programvarepakker for Imaging leserne13,14. I denne metoden beskrivelse, en menneskelig neural Stem Cell (NSC) linje som har blitt genetisk redigert til constitutively uttrykke tdTomato15 vil tjene som en test linje for å sammenligne cellulære levedyktighet resultater mellom en MTT-analysen og en automatisert celle telling analysen i en skjerm vurdere toksisitet av 57 test forbindelser. Selv om det primære målet med denne strategien var å identifisere og karakterisere giftige forbindelser, har den ekstra fordelen av potensielt identifisere veksthemmende og vekst styrke forbindelser og dermed gir en effektiv metode for å identifisere legemidler som kan modulere mobilnettet vekst.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. NSC-kultur
Merk: manipulering av en menneskelig NSC-linje vil bli beskrevet nedenfor, men en hvilken som helst cellelinje kan brukes for denne protokollen. Alle cellekultur arbeid utføres i et biologisk sikkerhetskabinett.
- Coat en 96-brønn plate med kjeller membran/ekstracellulære matrise (ECM).
- Tine alikvot av ECM (tabell av materialer), som vil lette vedlegg av NSC, på isen. Fortynne ECM til riktig konsentrasjon (vanligvis 1:100) i 10 mL basis medium (tabell av materialer) og tilsett 50 μL per brønn til hver av 60 innvendige brønner av en 96-brønn plate (figur 1). Bruk bare innvendige 60 brønner for å unngå artefakter som kan oppstå som følge av kant effekten16.
- La platen sitte ved romtemperatur eller i en cellekultur inkubator (37 ° c, 5% CO2) i minst 30 min.
- Distansere og plate nevrale stamceller.
Merk: celler for bruk i denne metoden bør dyrkes til minst 80% samløpet i en T75 kolbe.- Kultur celler i en T75 kolbe i en cellekultur inkubator ved 37 ° c og 5% CO2 i NSC medium som er sammensatt av base medium, B27, ikke-essensielle aminosyrer, 2 mm glutamin, og 10 ng/ml grunnleggende Fibroblast vekstfaktor (FGFB eller FGF2).
- Fjern celler fra inkubator når de når 80% samløpet og aspirer av NSC medium. Legg til en passende mengde celle dissosiasjon reagens (3 mL for en T75 kolbe; Tabell med materialer) og ruge i 5 minutter i inkubator.
- Etter inkubasjons, tilsett 7 mL NSC-medium i T75-flasken og Pipetter kraftig for å sikre at alle cellene løsner. Overfør den dissosiert celle løsningen til et 15 mL rør og sentrifuge ved 200 x g i 5 min.
- Etter sentrifugering, Fjern supernatanten fra røret og resuspend celler i 10 mL NSC-medium og telle celler.
- Juster konsentrasjonen av celler til 200 000-celler/mL med NSC-medium. Sørg for at cellene er fullt resuspendert for homogen plating i brønner.
- Plate 100 μL av celle blandingen (20 000 celler) i de 60 innvendige brønnene av 3 96-brønn plater som er belagt som beskrevet i avsnitt 1,1. Bruk seks av de åtte sporene i en 8-kanals flerkanals pipettehjelper til plate celler kolonne-for-kolonne.
- Tilsett 100 μL av base medium eller NSC medium til alle brønner uten celler for å minimere potensiell fordampning fra ytterste brønner.
- Under et cellekultur mikroskop, Inspiser visuelt minst 10 brønner på hver av de 3 96-brønn platene for å bekrefte at cellene er sådd ved forventet tetthet. Ikke Fortsett med analysen hvis cellene er belagt med en tetthet for sparsom eller tett.
2. behandle celler med forbindelser
Merk: hjemmelaget biblioteket testet i denne demonstrasjonen inneholder forbindelser som modulere vingeløse/integrert (wnt), retinoic syre, transformere vekstfaktor-beta (TGF-β), og Sonic Hedgehog signalering veier samt en rekke tyrosin kinaser.
-
Første lete skjerm for toksisitet/celle nummer
- Alikvot 50 − 100 mL av opp til 57 test forbindelser (supplerende tabell 1) ved en konsentrasjon på 10 mM i 100% dimethyl SULFOXIDE (DMSO) inn i interiøret 60 brønner av en U-bunn, V-bunn eller rund bunn 96-brønn plate med tre DMSO brønner som en kontroll (se Figur 1 for et plate kart). Dette vil fungere som Master sammensatte plate med 25 μL av sammensatte som kan fryses og tint flere ganger.
Merk: flat bunnplater bør ikke brukes som det vil være vanskeligere å aspirer små mengder forbindelser fra dem med en benk topp pipettehjelper. - Fjern cellekultur plater fra inkubator 16-24 med h etter splitting som beskrevet i avsnitt 1 og aspirer av NSC-medium Column-by-kolonne med en 8-kanals multi-Well-pipettehjelper med bare seks av de åtte fler brønn sporene. Tilsett 95 μL av friskt NSC-medium til celler i hver av de tre replikere platene og plasser platene tilbake i inkubator til trinn 2.1.4 nedenfor er fullført.
- Tilsett 49 μL av NSC-medium i hver av de innvendige 60 brønnene til en tom U-bunn, V-bunn eller en 96-brønn plate med 8-kanals multi-Well-pipettehjelper. Fjerne forseglingen hoved platen og bruk en benk pipettehjelper eller tilsvarende instrument til å pipette 1 μL av stoff fra master platen til 49 μL av NSC-medium i hver av de innvendige 60 brønnene.
- Bland fortynnet sammensatte 3x med benken toppen pipettehjelper.
- Fjern 3 96-brønn platene fra NSCs fra inkubator, Pipetter 15 μL av hver fortynnet forbindelse med Benke pipettehjelper og dispensere en 5 μL alikvot av sammensatte i hver av de tre platene.
Merk: denne 1:20 fortynning av sammensatte i cellene i kombinasjon med den første 1:50 fortynning i trinn 2.1.3 gir en 1:1000 fortynning slik at den endelige konsentrasjonen av forbindelsene på NSCs vil være 10 μM med DMSO konsentrasjon på 0,1% og den endelige konsentrasjonen for DMSO-kontrollene vil være 0,1%. - Ruge celler med sammensatte for 72 h og fortsette med cytotoksisitet analyser. Kortere intervaller kan brukes, men en 72-timers inkubasjonsperiode bør maksimere potensialet cytotoksisk effekter av testede forbindelser.
- Alikvot 50 − 100 mL av opp til 57 test forbindelser (supplerende tabell 1) ved en konsentrasjon på 10 mM i 100% dimethyl SULFOXIDE (DMSO) inn i interiøret 60 brønner av en U-bunn, V-bunn eller rund bunn 96-brønn plate med tre DMSO brønner som en kontroll (se Figur 1 for et plate kart). Dette vil fungere som Master sammensatte plate med 25 μL av sammensatte som kan fryses og tint flere ganger.
-
Dose respons analysen
Merk: oppsettet for 96-brønnen som brukes til dose responsen, vises i figur 2.- Bruk kolonne 2 for seks DMSO-kontroll replikerer og test triplicates av opptil tre forskjellige forbindelser ved to-fold seriell fortynninger ved seks doser som starter med en høy dose på 10 μM.
- Fortynne 4 μL av DMSO eller test sammensatte i DMSO i 196 μL av NSC-medium i et 1,5 mL mikrosentrifugen rør. Tilsett 25 μL av DMSO i kolonnen av brønner fra B2-G2 og 50 μL av test forbindelser til raden fra B3-b11 med de tre testede forbindelsene i 10 mM triplicates i rader B3-B5, B6-B8 og B9-b11.
- Pipetter 25 μL av NSC-medium til de resterende tomme kolonnene i den innvendige delen av 96-brønn platen. Fjern 25 μL av sammensatte fra brønner B3-b11 med en flerkanals pipettehjelper, Legg til brønner C3-C11, og bland minst fem ganger. Gjenta prosessen for de resterende radene for å generere triplicates på to-fold fortynninger for totalt seks doser for hver av forbindelsene.
- Generer NSCs for dose responsen nøyaktig slik det er beskrevet for hovedskjermen i avsnitt 2,1. Forbindelsene for dose responsen legges til og inkubert på cellene nøyaktig som beskrevet i trinn 2.1.5 og 2.1.6.
Merk: tre biologiske replikerer av dose respons analysen utføres ved å gjenta analysen på NSCs på ulike passasjer på separate dager.
3. Imaging celler på en plate leser
- Etter at cellene har blitt inkubert med forbindelser for den avsatte tiden, bilde celler på en plate leser for å bestemme pre-behandling celle nummer per brønn.
Merk: instruksjoner for bildebehandlings celler er leser spesifikke, men følger vanligvis en lignende strategi. Instruksjonene nedenfor gjelder for leseren som brukes i denne demonstrasjonen (tabell av materialer). - Fjern platen fra inkubator og plasser den inne i plate leseren. Åpne imager programvare for å sette opp protokollen og eksperiment filer for studien. Gå til imager manuell modus på Task Manager og klikk Capture nå....
- Velg 96-brønn plate som fartøy type, Velg 10x for forstørrelse, og rødt fluorescerende protein (RFP) 531 og 593 for Imaging tdTomato. Velg en brønn, og klikk deretter autofokus for å fokusere bildet, og Auto utsett for riktig eksponeringstid. Juster fokus og eksponering manuelt ved behov.
- Når riktig fokus og eksponering er oppnådd, klikker du på kameraikonet for å ta bildet. Klikk deretter Process/ANALZYE over bildet for å fortsette å bygge protokollen og velg kategorien analyse.
- Klikk på mobil analyse i Legg til analyse-trinn til høyre for bildet, og klikk på Start. Bildet vil vise markerte celler for å indikere hver enkelt celle. Alternativer-valget kan klikkes for å endre parametere for å bedre velge celler basert på fluorescens terskelen eller cellestørrelsen. Hvis imager er riktig telle cellene, og klikk Legg til trinn nederst på skjermen.
- Klikk på ikonet øverst på skjermen for å opprette eksperiment fra bilde sett, som åpner et vindu med eksperimentet. Når åpen, klikk prosedyre under kategorien protokoll og i det nye vinduet som åpner velger lese, deretter i det nye vinduet klikker du full plate for å velge bare 60 brønner som inneholder cellene (B2... G11). Klikk OK for å lagre endringene, og klikk deretter OK i prosedyre vinduet.
- Platen kan nå bli avbildet av denne protokollen og den eksperimentelle filen kan lagres. Klikk på avspillingsikonet for å kjøre platen. Når den første platen har blitt avbildet, bildet de to andre platene. Når du er ferdig med bildebehandling, laster du ned celle tellings dataene til et regneark for analyse. Ta alle bilder med 10x forstørrelse.
4. Terminal MTT cytotoksisitet-analysen
Merk: Start MTT-analysen innen to timer etter at du har fullført tdTomato Imaging.
- Lag en 5 mg/mL FLERBORDS lagerløsning ved å veie ut 25 mg MTT og blanding den i 5 mL NSC-medium. Vortex løsningen til det ikke er noen synlige precipitates av MTT, som kan ta flere minutter.
- Fjern cellekultur plater fra inkubator og aspirer av cellekultur medium. Fortynne MTT 1:10 i cellekultur medium og tilsett 100 μL av MTT til hver brønn av celler.
- Ruge celler ved 37 ° c for 2 t. En lilla utfelling bør være synlig omtrent i forhold til antall celler i brønnen. Enten aspirer MTT-løsningen av plater eller invertere platen raskt å flick løsning ut av platen.
- Tilsett 50 μL av 100% DMSO til hver brønn og riste plater ved romtemperatur i 10 min ved 400 RPM. Les absorbansen av hver brønn på 595 NM i en plate leser og eksportere data til et regneark for analyse.
5. data analyse
- Utfør en analyse av tdTomato celle tellinger og absorbances med riktig programvare (kommersielt regneark, R). Beregn gjennomsnitt for absorbansen eller celle telling av de tre DMSO-replikerer på hver plate for normalisering formål, deretter dele verdien for cellen teller eller absorbances for hver brønn på tallerkenen med dette gjennomsnittet og konvertere til en prosentandel. Dette gir normalisert celle Count eller absorbansen forhold til DMSO-kontroll for hver plate.
- Beregn gjennomsnittlig normalisert telling eller absorbansen og standardavvik for replikere brønner på de tre platene.
Merk: på dette punktet bør det være fire forskjellige sett med normalisert verdier: en for hver av platene og en mening for de tre replikere platene. - Vær konservativ og bruk en normalisert verdi på eller under 25% for gjennomsnittet på tvers av de tre replikere platene for å klassifisere en sammensatt som giftig. Også, fordi bare en enkelt behandling per sammensatte utføres på hver plate, bare etiketten forbindelser som faller under denne terskelen på alle tre replikere platene som giftig. Undersøk fluorescerende bilder av alle forbindelser som denne analysen filtrerer som giftig for visuelt å bekrefte toksisitet.
Merk: identifisering av forbindelser med en veksthemmende eller vekst styrke effekten er vanskeligere å vurdere i en undersøkende analysen av denne typen på grunn av mangel på replikerer på hver plate. Imidlertid er følgende en rask måte å identifisere forbindelser som kan enten avta eller forbedre mobilnettet vekst. - Beregn standardavviket for de tre replikere DMSO-kontrollene på hver plate, og Filtrer deretter etter alle forbindelser som har gjennomsnittlige verdier minst to standardavvik over eller under DMSO-kontrollen. Sammensetninger som faller ut av dette filteret på hver av de tre platene kan garantere videre etterforskning.
- Bruk samme analyse strategi for dose responsen som skjermen for primær toksisitet. Beregn gjennomsnittet for DMSO-kontrollene for hver biologiske replikere og bruk disse verdiene til å normalisere prosent aktive celler eller prosent absorbances for hver sammensatte/dosekombinasjon. Beregn midlene og standard feil av midlene for alle sammensatte/dose kombinasjoner for de tre biologiske replikerer.
- Forvandle konsentrasjonen til sin Logg verdi, generere en dose respons kurve for loggen av konsentrasjon versus normalisert levedyktighet, og passer kurven med en ikke-lineær regresjonsanalyse (analyse kan utføres i R eller ulike kommersielle statistiske pakker). Beregn den dødelige dosen 50 (eller teknisk i dette tilfellet levedyktig dose 50) eller konsentrasjon av sammensatte som resulterer i 50% toksisitet fra ligningen for denne kurven. Mange programvarepakker vil automatisk beregne dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den automatiserte celle telling data identifisert elleve forbindelser med mindre enn 25% levedyktighet når normalisert til DMSO-kontroll mens MTT data identifisert de samme forbindelsene pluss to ekstra seg (tabell 1 og tabell 2, skyggelagt rød). De to forbindelsene funnet å være giftig bare i MTT analysen (brønner F3 og G10) hadde 31% og 39%, henholdsvis antall tdTomato-positive celler som kontroll og ved rang orden var de neste to mest giftige forbindelser i dette biblioteket etter de anses å være giftig. Standardavviket verdier for disse to brønnene ikke tyder på at det var en avvikende blant de tre platene som skjev gjennomsnittet, og når undersøke tallene for hver av de tre replikere platene verken sammensatte falt under 25% terskelen på noen av platene (data ikke vist). Representative bilder av tdTomato fluorescens er vist fra flere brønner i Figur 3. Undersøkelse av bilder av de to brønnene avvikende for toksisitet mellom MTT og celle telling analysen avslørte at forbindelsene i F3 (Figur 3B) og G10 (Figur 3C) var både giftig selv i en av de tre replikere platene Det var noen få gjenværende levende celler i brønn G10 (data ikke vist). Det ser ut til at i dette tilfellet MTT analysen var bedre i stand til å score for cytotoksisitet som noen ganger imager ' s celle telling algoritme feilaktig teller døde/døende celler.
MTT-analysen er utformet for å bestemme toksisitet, men fordi et bibliotek kan inneholde forbindelser som forbedrer og hemmer cellevekst, vil det være informativt å vurdere hvor godt analysen kvantifiserer både den potensielle veksten hemmende og proliferativ virkningene av testet forbindelser. For å gjøre dette et filter ble brukt der forbindelsene ble klassifisert som veksthemmende hvis deres normalisert gjennomsnittlig absorbances eller celle tellinger var større enn 25% og mindre enn to standardavvik under kontroll betyr på hver av de tre replikere platene (skyggelagt gul i tabell 1 og tabell 2). Elleve forbindelser møtte dette kriteriet for celle tellingen analysen og bare to for MTT-analysen med bare én (E10) overlappende mellom de to analysene selv om to av de elleve for celle tellingen analysen var de tidligere nevnt å være giftig av MTT analysen (F3 , G10).
Forbindelser som normalisert midlene var to standardavvik over kontroll betyr på hver av de tre replikere platene ble klassifisert som vekst styrke (skyggelagt grønn i tabell 1 og tabell 2). Bare ett sammensatt passer dette kriteriet for hver analyse og sammensatt ikke overlapper mellom analysene. Videre undersøkelse av bilder av brønner med avvik mellom MTT og celle telling analysene indikerte at i noen tilfelle brønner der MTT overvurdert celle telling i forhold til tdTomato analysen cellene syntes å være større (Figur 3C) , mens de brønnene der MTT undervurdert celle telling i forhold til tdTomato cellene syntes å være mindre (Figur 3D). Oppsummert tdTomato analysen klassifisert elleve forbindelser som giftig, elleve som veksthemmende, og en som vekst styrke med 34 har ingen åpenbar effekt på cellevekst (tabell 1). Den MTT analysen klassifisert tretten forbindelser som giftig, to som veksthemmende, og en som vekst styrke med 41 har ingen åpenbar effekt på cellevekst (tabell 2).
En seks-punkts dose respons analysen ble gjennomført på tre av forbindelsene identifisert som giftig. Disse tre forbindelsene var STAT3-hemmere WP1066 (B5) og stattic (E4) og den epidermal vekstfaktorreseptor inhibitor tyrphostin 9 (E11). Dosene ble etterfølgende to ganger fortynninger, som starter med en maksimal konsentrasjon på 10 μM og som går til en minimums konsentrasjon på 312,5 nM. Grafen av loggen av konsentrasjon versus normalisert prosent av levedyktige celler for både celle telling og MTT analyser for en av disse forbindelsene (WP1066) er vist i Figur 4. Kurven er relativt flat uten toksisitet for de fire laveste konsentrasjonene, faller raskt på 5 μM dose, og synker til nesten full toksisitet ved 10 μM. Den dødelige dosen 50 (LD50) ble beregnet som 4,4 ΜM for tdTomato-analysen og 6,0 ΜM for MTT-analysen. TdTomato og MTT LD50 verdier for de to andre forbindelsene var henholdsvis 3,4 μm og 4,7 μm for statiske, og 0,8 μm og 1,6 μm, for tryphostin 9.
Figur 1 : Plate kart for Master sammensatte plate som brukes i den primære toksisitet skjermen. Alle ytre brønner er skyggelagt i grått, noe som indikerer at de inneholdt medier uten celler. DMSO-kontroller (100%) er merket med fet skrift i brønner B2, D6 og G11. Alle brønner merket Cmpd inneholdt unike test forbindelser ved 10 mM konsentrasjon i 100% DMSO. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Plate kart for den sammensatte platen som brukes i dose respons analysen. Alle de ytre brønnene er skyggelagt i grått som indikerer at de inneholdt bare medier uten celler. DMSO-kontrollene ble plassert i kolonne 2. Triplicates av alle sammensatte/dose kombinasjoner er indikert. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : tdTomato fluorescerende bilder av utvalgte brønner 72 timer etter behandling. (A) Vel B2: DMSO-kontroll, (B) Vel F3: celle tellings data foreslo ingen toksisitet, men MTT data did, (C) Vel E6: overvurdert celle telling av MTT i forhold til tdTomato teller, (D) Vel G6 undervurdert celle telling av MTT i forhold til tdTomato. Alle bilder ble tatt ved 10x forstørrelse ved hjelp av en RFP filter med 531/593 NM bølgelengde for eksitasjon/utslipp. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Kurve for Logg konsentrasjon versus levedyktighet prosent DMSO for sammensatte i godt B5. Punktene på kurven representerer gjennomsnittlig normalisert levedyktige celler ved seks doser ± standard feil av gjennomsnittet for tre biologiske replikerer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Tabell 1: hjelp av tdTomato celle tellinger normalisert til PROSENTVIS DMSO-kontroll for tre replikere plater ± standardavvik. Vel skyggelegging indikerer følgende: rød, giftige forbindelser; gul, potensielt veksthemmende; grønn, potensielt vekst styrke. Ingen skyggelegging indikerer at forbindelsene ikke ser ut til å påvirke celleveksten.
Tabell 2: hjelp av MTT absorbansen normalisert til PROSENTVIS DMSO-kontroll for tre gjenskape plater ± standardavvik. Vel skyggelegging indikerer følgende: rød, giftige forbindelser; gul, potensielt veksthemmende; grønn, potensielt vekst styrke. Ingen skyggelegging indikerer at forbindelsene ikke ser ut til å påvirke celleveksten.
| Godt | Sammensatte | Notater |
| B2 | Dmso | Negativ kontroll |
| C2 | Leiren | Protein kinase en aktivator |
| D2 | FRACTALKINE | Chemokine |
| E2 | LDN212854 | Bone Morfogenetiske protein (BMP) reseptor inhibitor |
| F2 | AG370 | Blodplate avledet vekstfaktorreseptor (PDGFR) kinase inhibitor |
| G2 | DAPT | Gamma-secretase hemmer; neuronal differensiering positiv kontroll |
| B3 | AY9944 | 7-dehydrocholestrol reduktase inhibitor; pinnsvin veien inhibitor |
| C3 | STA-21 | Signal svinger og aktivator av transkripsjon 3 (STAT3) inhibitor |
| D3 | GM-CSF | Granulkocyte-macrophage koloni-stimulerende faktor; Cytokin |
| E3 | TNP470 | Metionin aminipeptidase-2-hemmer |
| F3 | Bio | Glykogen syntase kinase-3 inhibitor; WNT veien aktivator |
| G3 | CNTF | Ciliary nevrotropisk faktor; neuropeptide |
| B4 | SANT | Glattes reseptor motstander; pinnsvin veien inhibitor |
| C4 | AG825 | ERBB2-hemmer |
| D4 | M-CSF | Macrophage koloni-stimulerende faktor; Cytokin |
| E4 | STATTIC | Signal svinger og aktivator av transkripsjon 3 (STAT3) inhibitor |
| F4 | SC79 | AKT (protein kinase B) aktivator |
| G4 | DMH1 | Bone Morfogenetiske protein (BMP) reseptor inhibitor |
| B5 | WP1066 | Signal svinger og aktivator av transkripsjon 3 (STAT3) inhibitor |
| C5 | Insulin | |
| D5 | IL-3 | Interleukin-3; Cytokin |
| E5 | AG494 | Epidermal vekstfaktorreseptor (EGFR) inhibitor |
| F5 | LY294002 | Phosphoinosotide 3-kinase inhibitor |
| G5 | IGF2 | insulin vekstfaktor-2 |
| B6 | Sag | Glattes Agonistiske; pinnsvin veien aktivator |
| C6 | AG370 | Blodplate avledet vekstfaktorreseptor kinase inhibitor |
| D6 | Dmso | Negativ kontroll |
| E6 | EC23 | Retinoic yre reseptor Agonistiske |
| F6 | TORIN2 | Mekanistisk mål for Rapamycin (MTOR)-hemmer |
| G6 | Y27362 | Rho-forbundet, spiral-spole som inneholder protein kinase (ROCK)-hemmer |
| B7 | CELECOXCIB | Cyclooxygenase-2 (COX-2) inhibitor |
| C7 | SB525334 | Transformere vekstfaktor beta-reseptor (TGBFR) inhibitor |
| D7 | DAPT | Gamma-secretase hemmer; neuronal differensiering positiv kontroll |
| E7 | CHIR99021 | Glykogen syntase kinase-3 inhibitor; WNT veien aktivator |
| F7 | LDN 193189 | Bone Morfogenetiske protein (BMP) reseptor inhibitor |
| G7 | TARAZOTINE | Retinoic yre reseptor Agonistiske |
| B8 | AM580 | Retinoic yre reseptor Agonistiske |
| C8 | DHBP | Kalsium Release inhibitor |
| D8 | JSK | Nitrogenoksid donor |
| E8 | DORSOMORPHIN | Bone Morfogenetiske protein (BMP) reseptor inhibitor; 5 ' adenosin monophospate-aktivert protein kinase (AMPK) inhibitor |
| F8 | Imatinib | Tyrosin kinase inhibitor |
| G8 | BMS 493 | invers retinoic syre reseptor Agonistiske |
| B9 | CYCLOPAMINE | Glattes reseptor motstander; pinnsvin veien inhibitor |
| C9 | SEMAGACESTAT | Gamma-secretase-hemmer |
| D9 | BOSUTINIB | Tyrosin kinase inhibitor |
| E9 | PURMORPHAMINE | Glattes Agonistiske; pinnsvin veien aktivator |
| F9 | JAG | Taggete Hakk reseptor Agonistiske |
| G9 | SB431542 | Transformere vekstfaktor beta-reseptor (TGBFR) inhibitor |
| B10 | SC79 | AKT (protein kinase B) aktivator |
| C10 | DANTROLEN | Ryanodine reseptor motstander |
| D10 | TYRPHOSTIN46 | Epidermal vekstfaktorreseptor (EGFR) inhibitor |
| E10 | AM80 | Retinoic yre reseptor Agonistiske |
| F10 | IFN-Y | interferon-gamma; Cytokin |
| G10 | PQ401 | Insulin-lignende vekstfaktorreseptor (IGF1R) inhibitor |
| B11 | DAPT | Gamma-secretase hemmer; neuronal differensiering positiv kontroll |
| C11 | A2M | Ekstracellulære glykoprotein; protease inhibitor |
| D11 | AG490 | Epidermal vekstfaktorreseptor (EGFR) inhibitor |
| E11 | TYRPHOSTIN9 | Blodplate avledet vekstfaktorreseptor (PDGFR) kinase inhibitor |
| F11 | BMP-2 | Bone Morfogenetiske protein-2 |
| G11 | Dmso | Negativ kontroll |
Supplerende tabell 1: liste over primærskjerm forbindelser. Vel plassering, navn, og notater på hver av forbindelsene som ble brukt i den primære skjermen er gitt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det primære målet med denne artikkelen var å beskrive en strategi som kan effektivt og rimelig identifisere forbindelser som påvirker cellevekst i en lav-til moderat gjennomstrømming screening. To ortogonale teknikker ble benyttet for å vurdere celle nummer for å øke tilliten til konklusjonene og tilby ytterligere innsikt som ikke ville være tilgjengelig hvis bare en enkelt analysen ble brukt. En av analysene brukt en fluorescerende celle imager å direkte telle tdTomato-positive celler og den andre var avhengig av godt preget evne til mitokondrier å holde MTT til formazans dermed tjene som en proxy for celle nummer10. Totalt 57 test forbindelser ble vurdert i denne demonstrasjonen selv MTT fløyen av analysen har blitt brukt for å teste et bibliotek med så mange som 2 000 sammensatte14. Resultatene av skjermen påpekte hvordan de to analysene kan forsterke hverandre i å nå visse konklusjoner med mer selvtillit, og fremhevet scenarier der de to analysene var komplementære gi ytterligere informasjon som ville vanligvis må utføre minst to separate eksperimenter.
Det mest kritiske trinnet i protokollen inntreffer like før cellene blir plating. Metabolske tilstander i celle kulturen kan bli svært volatile, spesielt i tilfelle av glutamin og glukose forbruk, hvis cellene er sådd ved for høy tetthet17,18. Under disse forholdene cellen død vil være på grunn av faktorer som ligger til celle kulturen forhold og ikke relatert til toksisitet av testede forbindelser. Resultatet vil bli en økning i falske positiver for cytotoksisk forbindelser, samt vanskeligheter med å reprodusere resultater18. Suksess på dette trinnet krever å vite den riktige celle tettheten av cellelinjen som brukes, nøyaktig bestemmelse av celle nummer før plating, og fullstendig blanding av celler for å sikre homogen plating fordeling innenfor og på tvers av brønnene i 96 -brønn plate. Det er også viktig å visuelt bekrefte at cellene er tilstede på omtrent riktig tetthet 2-3 h etter plating ved å se på dem under et mikroskop.
Såvidt analysene selv, det mest kritiske trinnet for MTT analysen er å sikre at MTT er fullstendig oppløst i cellen kultur medium. Resterende precipitates av MTT kan i seg selv føre til akutt cellulær toksisitet så det er viktig å fullstendig oppløse MTT med kraftig virvlingen. Det mest kritiske punktet for celle telling analysen er å etablere riktig eksponeringstid for Imaging tdTomato. Eksponeringstider som er for kort kan resultere i virkelig fluorescerende celler går uncounted av programvaren, og eksponeringstider som er for lange kan gjøre signalet så sterk at den blander nabokommunene celler sammen slik at programvaren teller flere celler som en celle fordi den ikke er i stand til å løse dem14. De fleste programvarepakker som følger med avbildnings lesere, åpner for et Forhåndsvisnings trinn som viser hvilke celler som telles. Det er viktig å kjøre denne forhåndsvisningen trinn på flere eksponeringstider og velge den som identifiserer fluorescerende celler mest nøyaktig.
Som med alle metoder er det visse begrensninger på disse analysene. For å få høyere gjennomstrømming, den primære toksisitet analysen bruker bare en enkelt behandling/enkelt dose paradigme som kan komme på bekostning av flere falske positiver og falske negativer. I tillegg, selv om flere tidligere studier har vist at MTT samsvarer veldig godt med celle nummer når du bruker enten en koloni forming analysen19 eller en tymidin innlemmelse asssay20, behandling med visse forbindelser kan enten forsterke eller hemme mitokondrie aktivitet på en slik måte at resultatene av MTT-analysen ikke lenger samsvarer med celle nummer21. Resultater fra denne demonstrasjonen tyder på at mens MTT er utmerket til å identifisere giftige forbindelser, dens evne til å identifisere forbindelser som enten hemmer eller forsterke spredning er begrenset kanskje fordi slike forbindelser endre mitokondrie aktivitet i en måte at den samsvarer mindre godt med celle nummer. Det er også noen begrensninger på tdTomato telling analysen. En åpenbar begrensning er behovet for å ha en cellelinje stabilt uttrykke et fluorescerende protein. Nylige fremskritt i Genova manipulasjon har gjort det mye lettere å utvikle slike linjer, men arbeidet som kreves for å generere dem kan være utenfor evnene til enkelte laboratorier. Fra et teknisk synspunkt, de største problemene med noen celle telling analysen som bruker bildeanalyse er manglende evne til disse analysene å skille mellom celler som er gruppert sammen resulterer i en undercount14, derfor riktig plating er avgjørende for nøyaktige resultater. Et annet potensielt problem er telling av døde eller døende celler som fluorescerer sterkt. En måte å unngå dette problemet er å vaske celler med PBS før telling for å fjerne disse bakgrunns celler. Dette kan ikke være praktisk for visse mindre godt å overholde celler linjer som levende celler kan løsne ved vasking. En alternativ løsning på dette problemet er å utnytte den fleksibiliteten som ligger i mange analyseprogrammer for å tilpasse parametrene for celle identifikasjon innenfor et smalt område, slik at bare leve, er fluorescerende celler telles.
Strategien som er beskrevet i denne artikkelen gir en effektiv måte å effektivt skjermen opp til flere hundre forbindelser. Den MTT analysen avlesning er fysiologisk resultat av mitokondrie aktivitet og kan ha cellelinje eller sammensatte-spesifikke effekter som kan gi unøyaktige resultater4,21. Ved å kombinere det med en celle telling analysen ved hjelp av en fluorescerende reporter, kan disse begrensningene være sterkt reduseres. Som vist, sammenligne resultatene av begge analysene kan resultere i nær 100% nøyaktighet i å identifisere giftige forbindelser. En tidligere studie har vist at i en HEK293T linje stabilt uttrykker tdTomato, det er høy IC50 korrelasjon mellom MTT og tdTomato for et bibliotek av giftige forbindelser22. Selv om denne studien ikke kjørte sekundære bekreftelser på nok treff forbindelser til å utføre en lignende samsvars analyse, var de beregnede LD50 -verdiene for de tre forbindelsene som ble testet, like.
I tillegg til deres evne til å forsterke konklusjoner om toksisitet, kan de to analysene utfylle hverandre når de adresserer den potensielle veksten hemmende og proliferativ effekter av test forbindelser. For flere test sammensetninger data mellom de to analysene skilt betydelig. Ved undersøkelse av bilder av tdTomato fluorescens for noen av disse forbindelsene, var det merkbare morfologiske endringer mellom behandling og kontroll. Dette tyder på at forskjellene i normalisert verdiene mellom de to analysene kan være basert på fysiologiske endringer som differensielt påvirke MTT avlesning og tdTomato celle telling. Evnen til å tilegne seg slike data med et enkelt eksperiment øker i stor grad robusthet i denne strategien, noe som gjør det mer generelt aktuelt. Som sådan, den har kapasitet ikke bare til å identifisere giftige forbindelser med høy nøyaktighet, men å påpeke forbindelser med mer subtile effekter på cellevekst/fysiologi som kan være mer omfattende preget.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av NINDS intramural Research program.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B-27 (50X) | ThermoFisher Scientific | 17504001 | Neural stem cell medium component. |
| BenchTop pipettor | Sorenson Bioscience | 73990 | Provides ability to pipette compound library into a 96-well plate in one shot. |
| BioLite 96 well multidish | Thermo Scientific | 130188 | Any 96 well cell culture plate will work. We use these in our work. |
| Cell culture microscope | Nikon | Eclipse TS100 | Visual inspection of cells to ensure proper density. |
| Cytation 5/ Imaging reader | BioTek | CYT3MFV | Used for cell imaging and absorbance readings. |
| DMSO | Fisher Scientific | 610420010 | Solvent for compounds used in screen. Dissolves MTT precipitates to facilitate absorbance measurements. |
| FGF-basic | Peprotech | 100-18B | Neural stem cell medium component. |
| GelTrex | ThermoFisher Scientific | A1413202 | Neural stem cell basement membrane matrix. Allows cells to attach to cell culture plates. |
| Gen5 3.04 | BioTek | Analysis software to determine cell counts for tdTomato expressing cells. | |
| Glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030081 | Neural stem cell medium component. |
| Microtest U-Bottom | Becton Dickinson | 3077 | Storage of compound libraries. |
| MTT | ThermoFisher Scientific | M6494 | Active assay reagent to determine cellular viability. |
| Multichannel pippette | Rainin | E8-1200 | Column-by-column addition of cell culture medium, MTT, or DMSO. |
| Neurobasal medium | ThermoFisher Scientific | 21103049 | Neural stem cell base medium. |
| RFP filter cube | BioTek | 1225103 | Filter in Cytation 5 used to image tdTomato expressing cells. |
| TrypLE | ThermoFisher Scientific | 12605036 | Cell dissociation reagent. |
References
- National Research Council. Toxicity Testing in the 21st century: A Vision and a Strategy. , National Academies Press. Washington DC. (2007).
- Llorens, J., Li, A. A., Ceccatelli, S., Sunol, C. Strategies and tools for preventing neurotoxicity: to Test, to predict, and how to do it. Neurotoxicology. 33 (4), 796-804 (2012).
- Adan, A., Kiraz, Y., Baran, Y. Cell proliferation and cytotoxicity assays. Current Pharmaceutical Biotechnology. 17 (14), 1213-1221 (2016).
- Ciofani, G., Danti, S., D'Alessandro, D., Moscato, S., Menciassi, A. Assessing cytotoxicity of boron nitride nanotubes: interference with the MTT assay. Biochemical and Biophysical Research Communications. 394 (2), 405-411 (2010).
- Tennant, J. R. Evaluation of the trypan blue technique for determination of cell viability. Transplantation. 2 (6), 685-694 (1964).
- Korzeniewski, C., Callewaert, D. M. An enzyme-release assay for natural cytotoxicity. Journal of Immunological Methods. 64 (3), 313-320 (1983).
- Ahmed, S. A., Gogal, R. M., Walsh, J. E. A new rapid and simple nonradioactive assay to monitor and determine the proliferation of lymphocytes: an alternative to [3H]thymidine incorporation assay. Journal of Immunological Methods. 170 (2), 211-224 (1994).
- Neri, S., Mariani, E., Meneghetti, A., Cattini, L., Facchini, A. Calcein-acetyoxymethyl cytotoxicity assay: Standardization of a method allowing additional analyses on recovered effector cells and supernatants. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 8 (6), 1131-1135 (2001).
- Crouch, S. P., Kozlowski, R., Slater, K. J., Fletcher, J. The use of ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity. Journal of Immunological Methods. 160 (1), 81-88 (1993).
- Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assay. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
- Berridge, M. V., Herst, P. M., Tan, A. S. Tetrazolium dyes as tools in cell biology: new insights into their cellular reduction. Biotechnology Annual Review. 11, 127-152 (2005).
- Malik, N., et al. Compounds with species and cell type specific toxicity identified in a 2000 compound drug screen of neural stem cells and rat mixed cortical neurons. Neurotoxicology. 45, 192-200 (2014).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. 7 (10), 100 (2006).
- Cerbini, T., et al. Transcription activator-like effector nuclease (TALEN)-mediated CLYBL targeting enables enhanced transgene expression and one-step generation of dual reporter human induced pluriopotent stem cell (iPSC) and neural stem cell (NSC) lines. PLoS One. 10 (1), 0116032 (2015).
- Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. Journal of Biomolecular Screening. 8 (5), 566-570 (2003).
- Qie, S., et al. Glutamine depletion and glucose depletion trigger growth inhibition via distinctive gene expression reprogramming. Cell Cycle. 11 (19), 3679-3690 (2012).
- Muelas, M. W., Ortega, F., Breitling, R., Bendtsen, C., Westerhoff, H. V. Rational cell culture optimization enhances experimental reproducibility in cancer cells. Scientific Reports. 8 (1), 3029 (2018).
- Carmichael, J., DeGraff, W. G., Gazdar, A. F., Minna, J. D., Mitchell, J. B. Evaluation of a tetrazolium-based semiautomated colorimetric assay: assessment of chemosensitivity testing. Cancer Research. 47 (4), 936-942 (1987).
- Romijn, J. C., Verkoelen, C. F., Schroeder, F. H. Application of the MTT assay to human prostate cancer cell lines in vitro: establishment of test conditions and assessment of hormone-stimulated growth and drug-induced cytostatic and cytotoxic effects. Prostate. 12 (1), 99-110 (1988).
- Jo, H. Y., et al. The unreliability of MTT assay in the cytotoxic test of primary cultured glioblastoma cells. Experimental Neurobiology. 24 (3), 235-245 (2015).
- Kalinina, M. A., Skvortsov, D. A., Rubtsova, M. P., Komarova, E. S., Dontsova, O. A. Cytotoxicity test based on human cells labeled with fluorescent proteins: photography, and scanning for high-throughput assay. Molecular Imaging and Biology. 20 (3), 368-377 (2018).
