مجموعة جاميت والإخصاب في المختبر من أسيتاناكس المكسيكية
Summary
الإخصاب في المختبر هو تقنية شائعة الاستخدام مع مجموعة متنوعة من الكائنات الحية النموذجية للحفاظ على مجموعات المختبرات وإنتاج الأجنة المتزامنة للتطبيقات النهائية. هنا، نقدم بروتوكول اطبق هذه التقنية لمختلف مجموعات الأسماك المكسيكية رباعي، Astyanax mexicanus.
Abstract
Astyanax mexicanus آخذ في الظهور ككائن حي نموذجي لمجموعة متنوعة من مجالات البحث في العلوم البيولوجية. جزء من النجاح أخيرة من هذا [تلّوست] سمكة نوع أنّ يملك هو يملك [إنترفيتيل] كهف و [ريفر-رلأيشن] مجموعة. وهذا يمكّن من رسم الخرائط الجينية للصفات القابلة للوراثة التي تم إصلاحها أثناء التكيف مع البيئات المختلفة لهذه التجمعات السكانية. في حين يمكن الحفاظ على هذا النوع وتربيته في المختبر، فإنه من الصعب على حد سواء الحصول على الأجنة خلال النهار وخلق الأجنة الهجينة بين سلالات. وقد استخدم الإخصاب في المختبر (IVF) مع مجموعة متنوعة من الكائنات الحية النموذجية المختلفة لتربية الحيوانات بنجاح وبشكل متكرر في المختبر. في هذا البروتوكول، نبين كيف، من خلال التأقلم مع A. mexicanus إلى دورات الضوء المختلفة إلى جانب التغيرات في درجة حرارة المياه، يمكننا تحويل دورات تربية إلى وقت مختار من اليوم. في وقت لاحق، نعرض كيفية تحديد الأسماك الأبوية المناسبة، وجمع الجيمات صحية من الذكور والإناث، وإنتاج ذرية قابلة للحياة باستخدام التلقيح الاصطناعي. وهذا يمكّن الإجراءات ذات الصلة مثل حقن المنشآت الوراثية أو تحليل النمو من أن تحدث خلال ساعات العمل العادية. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام هذه التقنية لخلق هجين بين الكهوف والسكان الذين يعيشون على السطح، وبالتالي تمكين دراسة الأساس الوراثي للتكيفات الفينوتية إلى بيئات مختلفة.
Introduction
في السنوات الأخيرة، أصبحت Astyanax mexicanus كائن حي نموذجي في مجالات مختلفة مثل البيولوجياالتنموية، والبيولوجيا التطورية، والبيولوجيا السلوكية، وعلم وظائف الأعضاء 1،2،3،4 . تفرد هذا النظام يأتي من هذا النوع وجود العديد من morphotypes التي تكيفت مع بيئات مختلفة جدا. يعيش النمط المورفي للمسكن السطحي في الأنهار حيث يوجد تنوع بيولوجي كبير والكثير من المصادر الغذائية للأسماك. وعلى النقيض من ذلك، فإن أنواع الكهوف من A. mexicanus، وسمك الكهف ، تعيش في الكهوف حيث التنوع البيولوجي ، ومصادر الغذاء ، والأكسجين تتضاءل بشكل كبير1. أسماك الكهف تختلف عن الأسماك السطحية في مجموعة متنوعة من الأنماط الظاهرية مثل غياب العينينوالتصبغ، ومقاومة الأنسولين، والقدرة على تخزين الدهون 2،3،4. ومع ذلك، فإن الأسماك السطحية وأسماك الكهف لا تزال تنتمي إلى نفس النوع، وبالتالي فهي التداخلية.
لكل من المورفوتاي، تم تحديد مجموعة من الشروط للسماحبالصيانة الروتينية والتكاثر في ظل الظروف المختبرية 5،6. ومع ذلك، لا تزال التعديلات الوراثية، والدراسات التنموية الجنينية السليمة، وخلق الهجينة تشكل تحديا لعدة أسباب. A. المكسيكية تفرخ في المقام الأول خلال ساعات الليل وهو أمر غير مريح للتجارب اللاحقة على المراحل الجنينية المبكرة مثل حقن المنشآت الوراثية أو رصد عمليات النمو الجنيني المبكر. وبالإضافة إلى ذلك، جيل من الهجينة السطحية والكهف هو التحدي باستخدام التفريخ الطبيعي، منذ morphotypes الكهف لديها إيقاع circadian تغيير7 التي تؤثر في نهاية المطاف على إنتاج البويضة قابلة للحياة. وقد تم وصف إجراءات التلقيح الاصطناعي الناجحة، ولكن الغازية، لأنواع أخرى من Astyanax، حيث تم إعداد إنتاج الجاميت والسلوك التفريخ باستخدام الحقن الهرمونية8،9. وقد تم وصف إجراءات التلقيح الاصطناعي أقل الغازية (أي الحصول على gametes من التفريخ اليدوي دون حقن الاستعدادات الهرمونية) ولكن لا تنظر في الاختلافات في دورة التفريخ بين الكهف والأنماط المورفولوجية السطحية من A. mexicanus 6.
ويمكن بسهولة تعديل الكائنات الحية النموذجية الأخرى للأسماك، مثل سمك الحمار الوحشي، ودراستها وراثيا على المستوى الجنيني لأن العقبات المذكورة أعلاه قد تم حلها بنجاح. وقد دفع تنفيذ تقنيات التربية الموحدة، والإخصاب في المختبر، والحفاظ على الحيوانات المنوية بالتبريد جميعها سمك الحمار الوحشي إلى الأمام وعزز استخدام النموذج في العلوم البيولوجية10. ولذلك، فإن توسيع نطاق هذه التقنيات إلى A. mexicanus سيزيد من تعزيزها كنظام نموذجي.
هنا، نقدم بروتوكول مفصل للإخصاب خارج الرحم من شأنها أن تساعد على جعل A. mexicanus أكثر سهولة. وسوف نقدم إعداد تربية التي تمكن من تحويل دورات الضوء من الأسماك من النهار إلى الليل بحيث يمكن الحصول على البويضة قابلة للحياة خلال ساعات النهار دون حقن المستحضرات الهرمونية. ثم نقدم وصفا مفصلا لكيفية الحصول على ova وmilt المستخدمة في التلقيح الاصطناعي. وستمكن هذه الطريقة من إنتاج الأجنة خلال ساعات العمل العادية وتجعل المزيد من التطبيقات النهائية أكثر جدوى مقارنة باستخدام الأجنة من التفريخ الطبيعي.
Protocol
Representative Results
Discussion
في حين أن التلقيح الاصطناعي هو طريقة موحدة للعديد من الكائنات الحية النموذجية المختلفة مثل حمار وحشي، والبروتوكولات القائمة لA. mexicanus لا تأخذ في الاعتبار أن هذا النوع يفرخ بشكل طبيعي خلال ساعات الليل6. وبالنظر إلى أن أسماك الكهف والأسماك السطحية تختلف اختلافا جذريا في إي?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويود المؤلفان أن يشكرا فيليب نوغيرا وكيمبرلي بلاند على دعمهما لإنتاج الفيديو. ويود المؤلفان أيضاً أن يعترفا بفريق الألعاب المائية بأكمله التابع لمعهد أبراج تربية الحيوانات. وقد تم دعم هذا العمل بتمويل مؤسسي من مكتب دعم التنمية والموارد الطبيعية. وقد حظيت المؤسسة بدعم مؤسسة إدوارد مالينكرودت وشركة JDRF. وكان البرنامج الوطني مدعوما بمنحة من شركة Forschungsgemeinschaft الألمانية (PE 2807/1-1).
Materials
| 0.6 mL Centrifuge Tube | Eppendorf | #22364111 | |
| 100 mm Petri Dishes | VWR International | #25384-302 | |
| Aspirator Tube | Drummond | #2-000-000 | |
| Calibrated 1-5 µL Capillary Tubes | Drummond | #2-000-001 | |
| Dispolable Spatulas | VWR International | #80081-188 | |
| HMA-50S 50W Aquatic Heaters | Finnex | HMA-50S | |
| P1000 Pipette | Eppendorf | #3123000063 | |
| P1000 Pipette Tips | Thermo Scientific | #2079E | |
| Sanyo MIR-554 incubator | Panasonic Health Care | MIR-554-PA | |
| Sperm Extender E400 | 130 mM KCl, 50 mM NaCl, 2 mM CaCl2 (2H2O), 1 mM MgSO4 (7H2O), 10 mM D (+)-Glucose, 30 mM HEPES Adjust to pH 7.9 with 5M KOH and filter sterilize. Solution can be stored at 4 ˚C for up to 6 months. |
||
| Sponge Animal Holder | Made from scrap foam | ||
| System Water | Deionized water supplemented with Instant Ocean Sea Salt [Blacksburg, VA] to reach a specific conductance of 800 µS/cm. Water quality parameters are maintained within safe limits (Upper limit of total ammonia nitrogen range, 1 mg/L; upper limit of nitrite range, 0.5 mg/L; upper limit of nitrate range, 60 mg/L; temperature, 22 °C; pH, 7.65; dissolved oxygen 100 %) | ||
| Tissue Wipes | Kimberly-Clark Professional | #21905-026 | |
| ZIRC E2 Embryo Media | 15 mM NaCl, 0.5 mM KCl, 1.0 mM MgSO4, 150 µM KH2PO4, 50 µM Na2HPO4, 1.0 mM CaCl2, 0.7 mM NaHCO3. Adjust pH to 7.2 to 7.4 using 2 N hydrochloric acid. Filter sterilize. Stored at room temperature for a maximum of two weeks. |
References
- Jeffery, W. R. Regressive evolution in Astyanax cavefish. Annual Review Genetics. 43, 25-47 (2009).
- Gross, J. B., Borowsky, R., Tabin, C. J. A novel role for Mc1r in the parallel evolution of depigmentation in independent populations of the cavefish Astyanax mexicanus. PLoS Genetics. 5, e1000326 (2009).
- Riddle, M. R., et al. Insulin resistance in cavefish as an adaptation to a nutrient-limited environment. Nature. 555, 647-651 (2018).
- Xiong, S., Krishnan, J., Peuß, R., Rohner, N. Early adipogenesis contributes to excess fat accumulation in cave populations of Astyanax mexicanus. Biologie du développement. 441 (2), 297-304 (2018).
- Borowsky, R. Breeding Astyanax mexicanus through Natural Spawning. COLD SPRING HARBOR Protocols. , (2008).
- Borowsky, R. In Vitro Fertilization of Astyanax mexicanus. COLD SPRING HARBOR Protocols. , (2008).
- Beale, A., et al. Circadian rhythms in Mexican blind cavefish Astyanax mexicanus in the lab and in the field. Nature Communications. 4, 2769 (2013).
- Sato, Y., Sampaio, E. V., Fenerich-Verani, N., Verani, J. R. Reproductive biology and induced breeding of two Characidae species (Osteichthyes, Characiformes) from the São Francisco River basin, Minas Gerais, Brazil. Revista Brasileira Zoology. 23 (1), 267-273 (2006).
- Yasui, G. S., et al. Improvement of gamete quality and its short-term storage: an approach for biotechnology in laboratory fish. Animal. 9 (3), 464-470 (2015).
- Westerfield, M. . The zebrafish book : a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Simon, V., Hyacinthe, C., Retaux, S. Breeding behavior in the blind Mexican cavefish and its river-dwelling conspecific. PLoS One. 14 (2), e0212591 (2019).
- Borowsky, R. Determining the Sex of Adult Astyanax mexicanus. COLD SPRING HARBOR Protocols. , (2008).
- Ross, L. G., Ross, B. . Anaesthetic and Sedative Techniques for Aquatic Animals. , (2008).
- Matthews, J. L., et al. Changes to Extender, Cryoprotective Medium, and In Vitro Fertilization Improve Zebrafish Sperm Cryopreservation. Zebrafish. 15 (3), 279-290 (2018).
- Stahl, B. A., et al. Stable transgenesis in Astyanax mexicanus using the Tol2 transposase system. Developmental Dynamics. , 1-9 (2019).
- Elipot, Y., Legendre, L., Pere, S., Sohm, F., Retaux, S. Astyanax transgenesis and husbandry: how cavefish enters the laboratory. Zebrafish. 11, 291-299 (2014).
- Gross, J. B., Borowsky, R., Tabin, C. J. A novel role for Mc1r in the parallel evolution of depigmentation in independent populations of the cavefish Astyanax mexicanus. PLoS Genetics. 5 (1), e1000326 (2009).
- Jeffery, W. R. Chapter 8. Evolution and development in the cavefish Astyanax. Current Topics in Developmental Biology. 86, 191-221 (2009).
- Protas, M., Conrad, M., Gross, J. B., Tabin, C., Borowsky, R. Regressive evolution in the Mexican cave tetra, Astyanax mexicanus. Current Biology. 17 (5), 452-454 (2007).
- Hinaux, H., et al. A developmental staging table for Astyanax mexicanus surface fish and Pachon cavefish. Zebrafish. 8, 155-165 (2011).
- Draper, B. W., Moens, C. B. A high-throughput method for zebrafish sperm cryopreservation and in vitro fertilization. Journal of Visualized Experiment. (29), (2009).
