Gamete collectie en in vitro fertilisatie van Astyanax mexicanus
Summary
In vitro fertilisatie is een veelgebruikte techniek met een verscheidenheid aan model organismen om labpopulaties te behouden en gesynchroniseerde embryo’s te produceren voor downstreamtoepassingen. Hier presenteren we een protocol dat deze techniek implementeert voor verschillende populaties van de Mexicaanse Tetra vissen, Astyanax mexicanus.
Abstract
Astyanax mexicanus is ontstaan als modelorganisme voor een verscheidenheid aan onderzoeksgebieden in de biologische wetenschap. Een deel van het recente succes van deze schip vissoorten is dat het een verstoorde grot en rivier bewoners bezit. Dit maakt de genetische mapping mogelijk van erfelijke eigenschappen die zijn vastgesteld tijdens de aanpassing aan de verschillende omgevingen van deze populaties. Hoewel deze soort in het Lab kan worden behouden en gefokt, is het uitdagend om beide overdag embryo’s te verkrijgen en hybride embryo’s tussen stammen te creëren. In vitro fertilisatie (IVF) is gebruikt met een verscheidenheid van verschillende model organismen om met succes en herhaaldelijk dieren te fokken in het laboratorium. In dit protocol laten we zien hoe, door het acclimatiseren van A. mexicanus aan verschillende licht cycli in combinatie met veranderingen in de watertemperatuur, we de kweek cycli kunnen verschuiven naar een gekozen tijdstip van de dag. Vervolgens laten we zien hoe geschikte oudervis te identificeren, gezonde gameten van mannetjes en vrouwtjes te verzamelen en levensvatbare nakomelingen te produceren met behulp van IVF. Hiermee kunnen gerelateerde procedures, zoals de injectie van genetische constructies of ontwikkelings analyse, plaatsvinden tijdens normale werkuren. Bovendien kan deze techniek worden gebruikt om hybriden te creëren tussen de grot en de oppervlaktewonertal, en daarmee de studie van de genetische basis van fenotypische aanpassingen aan verschillende omgevingen mogelijk te maken.
Introduction
In de afgelopen jaren, Astyanax mexicanus is uitgegroeid tot een modelorganisme in verschillende gebieden, zoals ontwikkelingsbiologie, evolutionaire biologie, gedragsbiologie, en fysiologie1,2,3,4 . De uniciteit van dit systeem komt van deze soort met verschillende vertegenwoordigen die zijn aangepast aan zeer verschillende omgevingen. De oppervlakte woning morphotype leeft in rivieren waar sprake is van een hoge biodiversiteit en veel voedselbronnen voor de vis. In tegenstelling, de grot vertegenwoordigen van A. mexicanus, de cavefish, leven in grotten waar de biodiversiteit, voedselbronnen en zuurstof drastisch worden verminderd1. Cavefish verschillen van de oppervlakte vis in een verscheidenheid van fenotypes zoals de afwezigheid van ogen en pigmentatie, insulineresistentie, en de mogelijkheid voor het opslaan van vet2,3,4. Echter, oppervlakte vissen en cavefish behoren nog steeds tot dezelfde soort en zijn daarom interfertile.
Voor beide morphotypen is een reeks voorwaarden gedefinieerd om routineonderhoud en kweek onder laboratoriumomstandigheden te kunnen toestaan op5,6. Echter, genetische modificaties, goede embryonale ontwikkelingsstudies, en de creatie van hybriden zijn nog steeds uitdagend om verschillende redenen. A. mexicanus spawnde voornamelijk tijdens nachturen wat lastig is voor latere experimenten op vroege embryonale stadia zoals injectie van genetische constructies of het monitoren van vroege embryonale ontwikkelingsprocessen. Daarnaast is het genereren van oppervlakte-en grot hybriden uitdagend met behulp van natuurlijke paai, omdat de grot vertegenwoordigen een veranderde circadiane ritme7 hebben die uiteindelijk de productie van levensvatbare eicellen beïnvloedt. Succesvolle, maar invasieve, IVF-procedures zijn beschreven voor andere Astyanax -soorten, waar de productie van gameten en paai gedrag werd klaar met behulp van hormonale injecties8,9. Minder invasieve IVF-procedures (d.w.z. het verkrijgen van gameten uit handmatige paai zonder de injectie van hormonale preparaten) zijn beschreven, maar beschouwen de verschillen in de paai cyclus tussen grot en oppervlakte vertegenwoordigen van A. mexicanus niet 6.
Andere vismodel organismen, zoals de zebravissen, kunnen gemakkelijk genetisch gemodificeerd zijn en op embryonale wijze worden bestudeerd, omdat de hierboven genoemde obstakels met succes zijn opgelost. De implementatie van gestandaardiseerde foktechnieken, in-vitro fertilisatie, en het gebruik van sperma-cryopreservering hebben de zebravis naar voren geschoven en het model in de biologische wetenschappen verstevigd10. Daarom zal het uitbreiden van deze technieken naar a. mexicanus het verder versterken als een modelsysteem.
Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor IVF dat zal helpen om a. mexicanus toegankelijker te maken. We zullen een fokopstelling presenteren die het mogelijk maakt om de licht cycli van de vis van overdag naar ‘s nachts te verschuiven, zodat levensvatbare eicellen kunnen worden verkregen tijdens de dag uren zonder injectie van hormonale preparaten. Vervolgens geven we een gedetailleerde beschrijving van het verkrijgen van de eicellen en milt die voor IVF worden gebruikt. Deze methode maakt de productie van embryo’s tijdens normale werkuren mogelijk en maakt verdere downstreamtoepassingen mogelijk in vergelijking met het gebruik van embryo’s van natuurlijke paaien.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hoewel IVF een gestandaardiseerde methode is voor veel verschillende model organismen zoals zebravissen, houden bestaande protocollen voor a. mexicanus geen rekening met het dat deze soort natuurlijk spawnt tijdens de nachturen6. Gezien het feit dat cavefish en oppervlakte vissen nogal drastisch verschillen in hun circadiane ritmes, verschilt de rijpings cyclus van de eicellen ook tussen de grot en de oppervlakte morphotypes. Terwijl de faserings temperaturen en-tijden voor Surface A….
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen Philippe Noguera en Kimberly Bland bedanken voor hun ondersteuning bij de videoproductie. De auteurs willen ook graag het hele team van Aquatics van het Stowers Institute for Animal husbandry erkennen. Dit werk werd gesteund door institutionele financiering aan DPB en NR. NR werd gesteund door de Edward Mallinckrodt Foundation en JDRF. RP werd gesteund door een subsidie van de Deutsche Forschungsgemeinschaft (PE 2807/1-1).
Materials
| 0.6 mL Centrifuge Tube | Eppendorf | #22364111 | |
| 100 mm Petri Dishes | VWR International | #25384-302 | |
| Aspirator Tube | Drummond | #2-000-000 | |
| Calibrated 1-5 µL Capillary Tubes | Drummond | #2-000-001 | |
| Dispolable Spatulas | VWR International | #80081-188 | |
| HMA-50S 50W Aquatic Heaters | Finnex | HMA-50S | |
| P1000 Pipette | Eppendorf | #3123000063 | |
| P1000 Pipette Tips | Thermo Scientific | #2079E | |
| Sanyo MIR-554 incubator | Panasonic Health Care | MIR-554-PA | |
| Sperm Extender E400 | 130 mM KCl, 50 mM NaCl, 2 mM CaCl2 (2H2O), 1 mM MgSO4 (7H2O), 10 mM D (+)-Glucose, 30 mM HEPES Adjust to pH 7.9 with 5M KOH and filter sterilize. Solution can be stored at 4 ˚C for up to 6 months. |
||
| Sponge Animal Holder | Made from scrap foam | ||
| System Water | Deionized water supplemented with Instant Ocean Sea Salt [Blacksburg, VA] to reach a specific conductance of 800 µS/cm. Water quality parameters are maintained within safe limits (Upper limit of total ammonia nitrogen range, 1 mg/L; upper limit of nitrite range, 0.5 mg/L; upper limit of nitrate range, 60 mg/L; temperature, 22 °C; pH, 7.65; dissolved oxygen 100 %) | ||
| Tissue Wipes | Kimberly-Clark Professional | #21905-026 | |
| ZIRC E2 Embryo Media | 15 mM NaCl, 0.5 mM KCl, 1.0 mM MgSO4, 150 µM KH2PO4, 50 µM Na2HPO4, 1.0 mM CaCl2, 0.7 mM NaHCO3. Adjust pH to 7.2 to 7.4 using 2 N hydrochloric acid. Filter sterilize. Stored at room temperature for a maximum of two weeks. |
References
- Jeffery, W. R. Regressive evolution in Astyanax cavefish. Annual Review Genetics. 43, 25-47 (2009).
- Gross, J. B., Borowsky, R., Tabin, C. J. A novel role for Mc1r in the parallel evolution of depigmentation in independent populations of the cavefish Astyanax mexicanus. PLoS Genetics. 5, e1000326 (2009).
- Riddle, M. R., et al. Insulin resistance in cavefish as an adaptation to a nutrient-limited environment. Nature. 555, 647-651 (2018).
- Xiong, S., Krishnan, J., Peuß, R., Rohner, N. Early adipogenesis contributes to excess fat accumulation in cave populations of Astyanax mexicanus. Biologie du développement. 441 (2), 297-304 (2018).
- Borowsky, R. Breeding Astyanax mexicanus through Natural Spawning. COLD SPRING HARBOR Protocols. , (2008).
- Borowsky, R. In Vitro Fertilization of Astyanax mexicanus. COLD SPRING HARBOR Protocols. , (2008).
- Beale, A., et al. Circadian rhythms in Mexican blind cavefish Astyanax mexicanus in the lab and in the field. Nature Communications. 4, 2769 (2013).
- Sato, Y., Sampaio, E. V., Fenerich-Verani, N., Verani, J. R. Reproductive biology and induced breeding of two Characidae species (Osteichthyes, Characiformes) from the São Francisco River basin, Minas Gerais, Brazil. Revista Brasileira Zoology. 23 (1), 267-273 (2006).
- Yasui, G. S., et al. Improvement of gamete quality and its short-term storage: an approach for biotechnology in laboratory fish. Animal. 9 (3), 464-470 (2015).
- Westerfield, M. . The zebrafish book : a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Simon, V., Hyacinthe, C., Retaux, S. Breeding behavior in the blind Mexican cavefish and its river-dwelling conspecific. PLoS One. 14 (2), e0212591 (2019).
- Borowsky, R. Determining the Sex of Adult Astyanax mexicanus. COLD SPRING HARBOR Protocols. , (2008).
- Ross, L. G., Ross, B. . Anaesthetic and Sedative Techniques for Aquatic Animals. , (2008).
- Matthews, J. L., et al. Changes to Extender, Cryoprotective Medium, and In Vitro Fertilization Improve Zebrafish Sperm Cryopreservation. Zebrafish. 15 (3), 279-290 (2018).
- Stahl, B. A., et al. Stable transgenesis in Astyanax mexicanus using the Tol2 transposase system. Developmental Dynamics. , 1-9 (2019).
- Elipot, Y., Legendre, L., Pere, S., Sohm, F., Retaux, S. Astyanax transgenesis and husbandry: how cavefish enters the laboratory. Zebrafish. 11, 291-299 (2014).
- Gross, J. B., Borowsky, R., Tabin, C. J. A novel role for Mc1r in the parallel evolution of depigmentation in independent populations of the cavefish Astyanax mexicanus. PLoS Genetics. 5 (1), e1000326 (2009).
- Jeffery, W. R. Chapter 8. Evolution and development in the cavefish Astyanax. Current Topics in Developmental Biology. 86, 191-221 (2009).
- Protas, M., Conrad, M., Gross, J. B., Tabin, C., Borowsky, R. Regressive evolution in the Mexican cave tetra, Astyanax mexicanus. Current Biology. 17 (5), 452-454 (2007).
- Hinaux, H., et al. A developmental staging table for Astyanax mexicanus surface fish and Pachon cavefish. Zebrafish. 8, 155-165 (2011).
- Draper, B. W., Moens, C. B. A high-throughput method for zebrafish sperm cryopreservation and in vitro fertilization. Journal of Visualized Experiment. (29), (2009).
