Collezione Gamete e Fecondazione in vitro di Astyanax mexicanus
Summary
La fecondazione in vitro è una tecnica comunemente utilizzata con una varietà di organismi modello per mantenere le popolazioni di laboratorio e produrre embrioni sincronizzati per applicazioni a valle. Qui, presentiamo un protocollo che implementa questa tecnica per diverse popolazioni del pesce tetra messicano, Astyanax mexicanus.
Abstract
Il messicano Astyanax sta emergendo come organismo modello per una varietà di campi di ricerca nella scienza biologica. Parte del recente successo di questa specie di pesci teleost è che possiede popolazioni interfertili di grotte e di riveri. Ciò consente la mappatura genetica dei tratti eritorabili che sono stati fissati durante l’adattamento ai diversi ambienti di queste popolazioni. Mentre questa specie può essere mantenuta e allevata in laboratorio, è difficile sia ottenere embrioni durante il giorno che creare embrioni ibridi tra i ceppi. La fecondazione in vitro (IVF) è stata utilizzata con una varietà di organismi modello diversi per allevare con successo e ripetutamente animali in laboratorio. In questo protocollo, mostriamo come, acclimatando A. mexicanus a diversi cicli di luce accoppiati con variazioni della temperatura dell’acqua, possiamo spostare i cicli riproduttivi a un momento scelto della giornata. Successivamente, mostriamo come identificare i pesci parentali adatti, raccogliere gameti sani da maschi e femmine e produrre prole vitale utilizzando la fecondazione in vitro. Ciò consente procedure correlate come l’iniezione di costrutti genetici o l’analisi dello sviluppo durante le normali ore di lavoro. Inoltre, questa tecnica può essere utilizzata per creare ibridi tra la grotta e le popolazioni che vivono in superficie, e quindi consentire lo studio della base genetica degli adattamenti fenotipici in ambienti diversi.
Introduction
Negli ultimi anni, Astyanax mexicanus è diventato un organismo modello in diversi campi come la biologia dello sviluppo, la biologia evolutiva, la biologia comportamentale e la fisiologia1,2,3,4 . L’unicità di questo sistema deriva da questa specie che ha diversi morfotipi che si sono adattati ad ambienti molto diversi. Il morfotipo di abitazione superficiale vive in fiumi dove c’è un’alta biodiversità e un sacco di fonti di cibo per il pesce. Al contrario, i morfotipi delle caverne di A. mexicanus,i pesci grotta, vivono in grotte dove la biodiversità, le fonti di cibo e l’ossigeno sono drasticamente diminuite1. I pesci cavernicolo differiscono dai pesci di superficie in una varietà di fenotipi come l’assenza di occhi e pigmentazione, insulino-resistenza e la capacità di immagazzinare grasso2,3,4. Tuttavia, i pesci di superficie e i pesci cavernile appartengono ancora alla stessa specie e sono, quindi, interfertili.
Per entrambi i morfotipi è stata definita una serie di condizioni per consentire la manutenzione e l’allevamento di routine in condizioni di laboratorio5,6. Tuttavia, le modifiche genetiche, i giusti studi sullo sviluppo embrionale e la creazione di ibridi sono ancora impegnativi per diversi motivi. A. mexicanus depongono principalmente le uova durante le ore notturne, il che è scomodo per i successivi esperimenti sulle prime fasi embrionali come l’iniezione di costrutti genetici o il monitoraggio dei primi processi di sviluppo embrionale. Inoltre, la generazione di ibridi di superficie e grotta è difficile con la deposizione naturale delle uova, poiché i morfotipi della grotta hanno un ritmo circadiano alterato7 che in ultima analisi influisce sulla produzione di ovuli vitali. Sono state descritte procedure di successo, ma invasive, in fecondazione in vitro per altre specie di Astyanax, dove la produzione di gameti e il comportamento riproduttivo sono stati innescati con iniezioni ormonali8,9. Sono state descritte procedure di fecondazione in vitro meno invasive (ad esempio, l’ottenimento di gameti dalla deposizione manuale delle uova senza l’iniezione di preparati ormonali) ma non considerano le differenze nel ciclo di deposizione delle uova tra morfotipi di grotta e superficie di A. mexicanus 6.
Altri organismi modello di pesce, come il pesce zebra, possono essere facilmente geneticamente modificati e studiati a livello embrionale perché gli ostacoli sopra indicati sono stati risolti con successo. L’implementazione di tecniche di allevamento standardizzate, fecondazione in vitro e crioconservazione dello sperma hanno tutti spinto il pesce zebra in avanti e solidificato l’uso del modello nelle scienze biologiche10. Pertanto, estendere queste tecniche ad A. mexicanus lo rafforzerà ulteriormente come sistema modello.
Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per la fecondazione in vitro che contribuirà a rendere A. mexicanus più accessibile. Presenteremo un setup di allevamento che consente di spostare i cicli di luce del pesce dal giorno alla notte in modo che gli ovuli vitali possano essere ottenuti durante le ore diurne senza iniezione di preparati ormonali. Forniamo quindi una descrizione dettagliata di come ottenere gli ovuli e i milt utilizzati per la fecondazione in vitro. Questo metodo consentirà la produzione di embrioni durante il normale orario di lavoro e renderà più fattibili ulteriori applicazioni a valle rispetto all’utilizzo di embrioni provenienti dalla deposizione naturale delle uova.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mentre la fecondazione in vitro è un metodo standardizzato per molti organismi modello diversi come il pesce zebra, i protocolli esistenti per A. mexicanus non tengono conto del fatto che questa specie depone naturalmente durante le ore notturne6. Dato che i pesci grotta e i pesci di superficie differiscono drasticamente nei loro ritmi circadiani, il ciclo di maturazione dell’ova differisce anche tra i morfotipi della grotta e della superficie. Mentre le temperature di messa in scena e i…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano Philippe Noguera e Kimberly Bland per il loro sostegno alla produzione video. Gli autori desiderano anche riconoscere l’intero team Aquatics dell’Istituto Stowers per l’allevamento degli animali. Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti istituzionali a DPB e NR. NR è stato sostenuto dalla Edward Mallinckrodt Foundation e dalla JDRF. RP è stato sostenuto da una sovvenzione della Deutsche Forschungsgemeinschaft (PE 2807/1-1).
Materials
| 0.6 mL Centrifuge Tube | Eppendorf | #22364111 | |
| 100 mm Petri Dishes | VWR International | #25384-302 | |
| Aspirator Tube | Drummond | #2-000-000 | |
| Calibrated 1-5 µL Capillary Tubes | Drummond | #2-000-001 | |
| Dispolable Spatulas | VWR International | #80081-188 | |
| HMA-50S 50W Aquatic Heaters | Finnex | HMA-50S | |
| P1000 Pipette | Eppendorf | #3123000063 | |
| P1000 Pipette Tips | Thermo Scientific | #2079E | |
| Sanyo MIR-554 incubator | Panasonic Health Care | MIR-554-PA | |
| Sperm Extender E400 | 130 mM KCl, 50 mM NaCl, 2 mM CaCl2 (2H2O), 1 mM MgSO4 (7H2O), 10 mM D (+)-Glucose, 30 mM HEPES Adjust to pH 7.9 with 5M KOH and filter sterilize. Solution can be stored at 4 ˚C for up to 6 months. |
||
| Sponge Animal Holder | Made from scrap foam | ||
| System Water | Deionized water supplemented with Instant Ocean Sea Salt [Blacksburg, VA] to reach a specific conductance of 800 µS/cm. Water quality parameters are maintained within safe limits (Upper limit of total ammonia nitrogen range, 1 mg/L; upper limit of nitrite range, 0.5 mg/L; upper limit of nitrate range, 60 mg/L; temperature, 22 °C; pH, 7.65; dissolved oxygen 100 %) | ||
| Tissue Wipes | Kimberly-Clark Professional | #21905-026 | |
| ZIRC E2 Embryo Media | 15 mM NaCl, 0.5 mM KCl, 1.0 mM MgSO4, 150 µM KH2PO4, 50 µM Na2HPO4, 1.0 mM CaCl2, 0.7 mM NaHCO3. Adjust pH to 7.2 to 7.4 using 2 N hydrochloric acid. Filter sterilize. Stored at room temperature for a maximum of two weeks. |
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