אוסף המשחק ו הפריה חוץ גופית של Astyanax מקסיאנוס
Summary
הפריה חוץ גופית היא טכניקה בשימוש נפוץ עם מגוון רחב של אורגניזמים מודל לשמור על אוכלוסיות מעבדה לייצר עוברים מסונכרנים עבור יישומים במורד הזרם. כאן, אנו מציגים פרוטוקול המיישם טכניקה זו עבור אוכלוסיות שונות של הדגים טטרה מקסיקני, Astyanaxמקסיקני.
Abstract
הטבעת התחתית Astyanax מתגלה כאורגניזם מודל למגוון שדות מחקר במדעי הביולוגיה. חלק מן ההצלחה האחרונה של מינים זה של דגים teleost היא שהיא בעלת מערת הפרעות ואוכלוסיות מגורים הנהר. זה מאפשר את המיפוי הגנטי של תכונות תורשתיות שתוקנו במהלך הסתגלות לסביבות שונות של אוכלוסיות אלה. בעוד המין הזה יכול להיות מתוחזק ומתרבה במעבדה, הוא מאתגר הן להשיג עוברים במהלך היום וליצור עוברים היברידית בין זנים. הפריה חוץ גופית (IVF) נעשה שימוש עם מגוון רחב של אורגניזמים מודל שונים בהצלחה ומתרבים בעלי חיים במעבדה. בפרוטוקול זה, אנו מראים כיצד, על ידי הערכת מחזורי הטבעת למחזורי אור שונים יחד עם שינויים בטמפרטורת המים, אנו יכולים להעביר מחזורי רבייה לתקופה שנבחרה ביום. לאחר מכן, אנו מראים כיצד לזהות דגים הורים מתאימים, לאסוף גמטות בריאים מן הזכרים והנקבות, ולייצר צאצאים קיימא באמצעות IVF. הדבר מאפשר הליכים קשורים כגון הזרקה של מבנים גנטיים או ניתוח התפתחותי שיתרחשו בשעות העבודה הרגילות. יתר על כן, טכניקה זו ניתן להשתמש כדי ליצור כלאיים בין אוכלוסיות מערה משטח הקרקע, ובכך לאפשר את המחקר של הבסיס הגנטי של עיבודים פנוטימית לסביבות שונות.
Introduction
בשנים האחרונות הפכה Astyanax מקסיפי-הטבעת לאורגניזם מודל בתחומים שונים כגון ביולוגיה התפתחותית, ביולוגיה אבולוציונית, ביולוגיה התנהגותית ופיזיולוגיה1,2,3,4 . ייחודו של מערכת זו נובע ממין זה שיש לו מספר מורורפולסוגים שמותאמים לסביבות שונות מאוד. מגורים הקרקע מורפולאות חיים בנהרות שם יש מגוון ביולוגי גבוה והרבה מקורות מזון עבור הדג. לעומת זאת, המערה מורערת מהמינים של מקסיפי-הטבעת, החיים במערות שבהן המגוון הביולוגי, מקורות המזון והחמצן מופחת באופן דרסטי1. מכפיש שונים מדגי השטח במגוון פנוטיפים כגון העדר עיניים ופיגמנטציה, עמידות לאינסולין ויכולת לאגור שומן2,3,4. עם זאת, דגי שטח ומכפיש עדיין שייכים לאותו מינים והם, ולכן, הפרעות.
עבור שני המורפולונים, מערכת תנאים הוגדרה כדי לאפשר תחזוקה שוטפת ורביה בתנאי מעבדה5,6. עם זאת, שינויים גנטיים, מחקרים התפתחותיים עובריים נכונה, ויצירת כלאיים הם עדיין מאתגרת מכמה סיבות. A. מקסיפי בעיקר שרצים בשעות הלילה וזה לא נוח לניסויים הבאים על שלבים עובריים מוקדם כגון הזרקה של מבנים גנטיים או ניטור של תהליכים התפתחותיים מוקדם עובריים. בנוסף, הדור של משטח ההיברידים המערה הוא מאתגר באמצעות השפעה טבעית, מאז מערת מורפולסוגים יש קצב מעגלי שונה7 כי בסופו של דבר משפיע על הייצור של בעלות קיימא. מוצלח, עדיין פולשנית, הליכים IVF תוארו עבור מינים astyanax אחרים, שם הייצור תא רבייה והתנהגות הבהורית היה מוכן באמצעות זריקות הורמונליים8,9. פחות פולשנית הליכי IVF (כלומר, השגת גמטות מתוך השאיפה ידנית ללא הזרקה של ההכנות ההורמונלית) תוארו אך לא לשקול את ההבדלים במחזור ההשמה בין מערה ומשטח המורפולטים של מקסיאנוס . שישה מטרים
דגים אחרים מודל אורגניזמים, כמו דג zebrafish, יכול בקלות להיות מהונדסים גנטית ולמד ברמה עובריים כי המכשולים הצהיר לעיל כבר נפתרה בהצלחה. יישום של טכניקות רבייה סטנדרטיות, הפריה חוץ גופית, והקפאת הזרע כל דחפו את הדגים קדימה והתחזק את השימוש של המודל במדעי הביולוגיה10. לכן, הארכת טכניקות אלה ל -מקסיפי-טבעת תחזק אותה עוד יותר כמערכת מודל.
כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט עבור IVF שיסייע להפוך את מקסינוס נגיש יותר. אנו נציג הגדרת הרבייה המאפשרת העברת מחזורי אור של הדג משעות היום ללילה, כך שניתן להשיג באותה תקופה בשעות היום ללא הזרקה של ההכנות ההורמונלית. לאחר מכן אנו מספקים תיאור מפורט של כיצד להשיג את הטוב ומילט המשמש IVF. שיטה זו תאפשר את ייצור העוברים במהלך שעות העבודה הרגיל ולהפוך יישומים במורד הזרם יותר ריאלי לעומת שימוש בעוברים מתוך הליכה טבעית.
Protocol
Representative Results
Discussion
בעוד IVF היא שיטה סטנדרטית עבור אורגניזמים רבים מודל שונים כגון zebrafish, פרוטוקולים קיימים עבור מקסיפי הטבעת לא לקחת בחשבון כי זן זה מולידה באופן טבעי בשעות הלילה6. בהתחשב בעובדה כי דגי מערות ומשטח שונים באופן דרסטי למדי במקצבים שלהם, מחזור ההבשלה של הנובה שונה גם בין מערת ומ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצים להודות לפיליפ נוגורה וקימברלי באנד על תמיכתם בהפקת וידאו. המחברים גם רוצים להכיר בצוות השלם של מכון הסטודרים לגידול בעלי חיים. עבודה זו תמכה במימון מוסדי ל-DPB ו-NR. ע”נ נתמך על ידי קרן אדוארד מלנקס ו JDRF. RP היה נתמך על ידי מענק מתוך הגרמני Forschsgeמייסמייסםהירכתיים (PE 2807/1-1).
Materials
| 0.6 mL Centrifuge Tube | Eppendorf | #22364111 | |
| 100 mm Petri Dishes | VWR International | #25384-302 | |
| Aspirator Tube | Drummond | #2-000-000 | |
| Calibrated 1-5 µL Capillary Tubes | Drummond | #2-000-001 | |
| Dispolable Spatulas | VWR International | #80081-188 | |
| HMA-50S 50W Aquatic Heaters | Finnex | HMA-50S | |
| P1000 Pipette | Eppendorf | #3123000063 | |
| P1000 Pipette Tips | Thermo Scientific | #2079E | |
| Sanyo MIR-554 incubator | Panasonic Health Care | MIR-554-PA | |
| Sperm Extender E400 | 130 mM KCl, 50 mM NaCl, 2 mM CaCl2 (2H2O), 1 mM MgSO4 (7H2O), 10 mM D (+)-Glucose, 30 mM HEPES Adjust to pH 7.9 with 5M KOH and filter sterilize. Solution can be stored at 4 ˚C for up to 6 months. |
||
| Sponge Animal Holder | Made from scrap foam | ||
| System Water | Deionized water supplemented with Instant Ocean Sea Salt [Blacksburg, VA] to reach a specific conductance of 800 µS/cm. Water quality parameters are maintained within safe limits (Upper limit of total ammonia nitrogen range, 1 mg/L; upper limit of nitrite range, 0.5 mg/L; upper limit of nitrate range, 60 mg/L; temperature, 22 °C; pH, 7.65; dissolved oxygen 100 %) | ||
| Tissue Wipes | Kimberly-Clark Professional | #21905-026 | |
| ZIRC E2 Embryo Media | 15 mM NaCl, 0.5 mM KCl, 1.0 mM MgSO4, 150 µM KH2PO4, 50 µM Na2HPO4, 1.0 mM CaCl2, 0.7 mM NaHCO3. Adjust pH to 7.2 to 7.4 using 2 N hydrochloric acid. Filter sterilize. Stored at room temperature for a maximum of two weeks. |
References
- Jeffery, W. R. Regressive evolution in Astyanax cavefish. Annual Review Genetics. 43, 25-47 (2009).
- Gross, J. B., Borowsky, R., Tabin, C. J. A novel role for Mc1r in the parallel evolution of depigmentation in independent populations of the cavefish Astyanax mexicanus. PLoS Genetics. 5, e1000326 (2009).
- Riddle, M. R., et al. Insulin resistance in cavefish as an adaptation to a nutrient-limited environment. Nature. 555, 647-651 (2018).
- Xiong, S., Krishnan, J., Peuß, R., Rohner, N. Early adipogenesis contributes to excess fat accumulation in cave populations of Astyanax mexicanus. Biologie du développement. 441 (2), 297-304 (2018).
- Borowsky, R. Breeding Astyanax mexicanus through Natural Spawning. COLD SPRING HARBOR Protocols. , (2008).
- Borowsky, R. In Vitro Fertilization of Astyanax mexicanus. COLD SPRING HARBOR Protocols. , (2008).
- Beale, A., et al. Circadian rhythms in Mexican blind cavefish Astyanax mexicanus in the lab and in the field. Nature Communications. 4, 2769 (2013).
- Sato, Y., Sampaio, E. V., Fenerich-Verani, N., Verani, J. R. Reproductive biology and induced breeding of two Characidae species (Osteichthyes, Characiformes) from the São Francisco River basin, Minas Gerais, Brazil. Revista Brasileira Zoology. 23 (1), 267-273 (2006).
- Yasui, G. S., et al. Improvement of gamete quality and its short-term storage: an approach for biotechnology in laboratory fish. Animal. 9 (3), 464-470 (2015).
- Westerfield, M. . The zebrafish book : a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Simon, V., Hyacinthe, C., Retaux, S. Breeding behavior in the blind Mexican cavefish and its river-dwelling conspecific. PLoS One. 14 (2), e0212591 (2019).
- Borowsky, R. Determining the Sex of Adult Astyanax mexicanus. COLD SPRING HARBOR Protocols. , (2008).
- Ross, L. G., Ross, B. . Anaesthetic and Sedative Techniques for Aquatic Animals. , (2008).
- Matthews, J. L., et al. Changes to Extender, Cryoprotective Medium, and In Vitro Fertilization Improve Zebrafish Sperm Cryopreservation. Zebrafish. 15 (3), 279-290 (2018).
- Stahl, B. A., et al. Stable transgenesis in Astyanax mexicanus using the Tol2 transposase system. Developmental Dynamics. , 1-9 (2019).
- Elipot, Y., Legendre, L., Pere, S., Sohm, F., Retaux, S. Astyanax transgenesis and husbandry: how cavefish enters the laboratory. Zebrafish. 11, 291-299 (2014).
- Gross, J. B., Borowsky, R., Tabin, C. J. A novel role for Mc1r in the parallel evolution of depigmentation in independent populations of the cavefish Astyanax mexicanus. PLoS Genetics. 5 (1), e1000326 (2009).
- Jeffery, W. R. Chapter 8. Evolution and development in the cavefish Astyanax. Current Topics in Developmental Biology. 86, 191-221 (2009).
- Protas, M., Conrad, M., Gross, J. B., Tabin, C., Borowsky, R. Regressive evolution in the Mexican cave tetra, Astyanax mexicanus. Current Biology. 17 (5), 452-454 (2007).
- Hinaux, H., et al. A developmental staging table for Astyanax mexicanus surface fish and Pachon cavefish. Zebrafish. 8, 155-165 (2011).
- Draper, B. W., Moens, C. B. A high-throughput method for zebrafish sperm cryopreservation and in vitro fertilization. Journal of Visualized Experiment. (29), (2009).
