Coleção gamete e fertilização in vitro de Astyanax mexicanus

Summary

A fertilização in vitro é uma técnica comumente utilizada com uma variedade de organismos modelo para manter as populações de laboratório e produzir embriões sincronizados para aplicações a jusante. Aqui, apresentamos um protocolo que implementa esta técnica para diferentes populações do peixe Tetra mexicano, Astyanax mexicanus.

Abstract

Astyanax mexicanus está emergindo como um organismo modelo para uma variedade de campos de pesquisa na ciência biológica. Parte do sucesso recente desta espécie de peixe teleósteo é que possui caverna cruzar e populações de Rio-habitação. Isso possibilita o mapeamento genético de traços hereditários que foram fixados durante a adaptação aos diferentes ambientes dessas populações. Enquanto esta espécie pode ser mantida e criada no laboratório, é desafiador tanto para obter embriões durante o dia e criar embriões híbridos entre as cepas. In vitro a fertilização (IVF) foi usada com uma variedade de organismos modelo diferentes para produzir com sucesso e repetidamente animais no laboratório. Neste protocolo, mostramos como, aclimatizando a . mexicanus a diferentes ciclos de luz juntamente com mudanças na temperatura da água, podemos mudar os ciclos de reprodução para uma hora escolhida do dia. Posteriormente, mostramos como identificar peixes parentais adequados, coletar gametas saudáveis de machos e fêmeas, e produzir progênies viáveis usando FIV. Isto permite procedimentos relacionados tais como a injeção de construções genéticas ou a análise desenvolvente a ocorrer durante horas de trabalho normais. Além disso, esta técnica pode ser usada para criar híbridos entre as populações de cavernas e de superfície, e assim possibilitar o estudo da base genética de adaptações fenotípicas a diferentes ambientes.

Introduction

Nos últimos anos, Astyanax mexicanus tornou-se um organismo modelo em diferentes áreas, como biologia do desenvolvimento, biologia evolutiva, biologia comportamental e fisiologia^1,2,3,4 . A singularidade deste sistema vem desta espécie tendo vários morfotipos que se adaptaram a ambientes muito diferentes. O Morfotipo da habitação de superfície vive nos rios onde há uma biodiversidade elevada e uma abundância de fontes de alimento para os peixes. Em contraste, os morfotipos de caverna de a. mexicanus, o cavefish, vivem em cavernas onde A biodiversidade, fontes de alimentos e oxigênio são drasticamente diminuídos¹. Cavefish diferem dos peixes de superfície em uma variedade de fenótipos tais como a ausência de olhos e de pigmentação, resistência de insulin, e a habilidade de armazenar a gordura^2,3,4. No entanto, peixes de superfície e cavefish ainda pertencem à mesma espécie e são, portanto, interfertile.

Para ambos os morfotipos, definiu-se um conjunto de condições para permitir a manutenção e reprodução rotineiras em condições laboratoriais^5,6. Entretanto, as modificações genéticas, os estudos de desenvolvimento embrionário apropriados, e a criação dos híbridos são ainda desafiantes por diversas razões. A. mexicanus primeiramente desova durante horas da noite que é inconveniente para experiências subseqüentes em estágios embrionário adiantados tais como a injeção de construções genéticas ou a monitoração de processos de desenvolvimento embrionário adiantados. Além disso, a geração de híbridos de superfície e caverna é desafiadora usando a desova natural, uma vez que os morfotipos da caverna têm um ritmo circadiano alterado⁷ que, em última análise, afeta a produção de óvulos viáveis. Procedimentos de fertilização in vitro bem sucedidos, porém invasivos, foram descritos para outras espécies de Astyanax , onde a produção de gameta e o comportamento de desova foram aprontado usando injeções hormonais^8,9. Procedimentos de fertilização in vitro menos invasivos (i.e., obtenção de gametas de desova manual sem a injeção de preparações hormonais) têm sido descritos, mas não consideram as diferenças no ciclo de desova entre os morfotipos de caverna e superfície de a. mexicanus a ⁶.

Outros organismos do modelo de peixe, como o zebrafish, podem ser facilmente modificados geneticamente e estudados a um nível embrionário, porque os obstáculos acima mencionados foram resolvidos com sucesso. A implementação de técnicas padronizadas de melhoramento genético, fertilização in vitro e criopreservação de espermatozóides têm empurrado o zebrafish para frente e solidificado o uso do modelo nas ciências biológicas¹⁰. Portanto, estender essas técnicas para a . mexicanus irá fortalecê-lo como um sistema modelo.

Aqui, nós apresentamos um protocolo detalhado para o IVF que ajudará a fazer a . mexicanus mais acessível. Apresentaremos uma configuração de reprodução que permite deslocar os ciclos de luz dos peixes de dia para noite para que os óvulos viáveis possam ser obtidos durante o dia sem injeção de preparações hormonais. Nós, então, fornecer uma descrição detalhada de como obter os óvulos e Milt usado para IVF. Este método permitirá a produção de embriões durante o horário de trabalho normal e tornará mais viável a jusante aplicações em comparação com o uso de embriões de desova natural.

Protocol

Todos os métodos aqui descritos foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidado e uso de animais (IACUC) do Instituto de pesquisas médicas da Stowers. 1. manipulação de ciclo claro Configurar tanques de peixes dentro de um opaco, totalmente fechado (proteção de luz), fluxo-através do sistema de aquicultura contendo várias fileiras de tanques (Figura 1).Nota: o sistema de escoamento, como mostrado na Figura 1</strong…

Representative Results

O protocolo apresentado aqui é baseado principalmente em um protocolo previamente publicado6. No entanto, desde a. mexicanus gera durante as horas noturnas, nós projetamos um rack de habitação para a criação de peixes que pode mudar o fotoperíodo independente do horário de trabalho (Figura 1). O ciclo de luz dos peixes é alterado dentro de um sistema de aquicultura totalmente fechado, que contém três fileiras de tan…

Discussion

Enquanto IVF é um método padronizado para muitos organismos modelo diferentes, como zebrafish, protocolos existentes para a. mexicanus não levam em conta que esta espécie naturalmente gera durante as horas noturnas⁶. Dado que os peixes cavefish e de superfície diferem completamente dràstica em seus ritmos circadiano, o ciclo da maturação dos óvulos igualmente difere entre os morphotypes da caverna e da superfície. Enquanto as temperaturas de preparo e as horas para a superf?…

Materials

0.6 mL Centrifuge Tube	Eppendorf	#22364111
100 mm Petri Dishes	VWR International	#25384-302
Aspirator Tube	Drummond	#2-000-000
Calibrated 1-5 µL Capillary Tubes	Drummond	#2-000-001
Dispolable Spatulas	VWR International	#80081-188
HMA-50S  50W Aquatic Heaters	Finnex	HMA-50S
P1000 Pipette	Eppendorf	#3123000063
P1000 Pipette Tips	Thermo Scientific	#2079E
Sanyo MIR-554 incubator	Panasonic Health Care	MIR-554-PA
Sperm Extender E400			130 mM KCl, 50 mM NaCl, 2 mM CaCl2 (2H2O), 1 mM MgSO4 (7H2O), 10 mM D (+)-Glucose, 30 mM HEPES Adjust to pH 7.9 with  5M KOH and filter sterilize. Solution can be stored at 4 ˚C for up to 6 months.
Sponge Animal Holder			Made from scrap foam
System Water			Deionized water supplemented with Instant Ocean Sea Salt [Blacksburg, VA] to reach a specific conductance of 800 µS/cm.  Water quality parameters are maintained within safe limits (Upper limit of total ammonia nitrogen range, 1 mg/L; upper limit of nitrite range, 0.5 mg/L; upper limit of nitrate range, 60 mg/L; temperature, 22 °C; pH, 7.65; dissolved oxygen 100 %)
Tissue Wipes	Kimberly-Clark Professional	#21905-026
ZIRC E2 Embryo Media			15 mM NaCl, 0.5 mM KCl, 1.0 mM MgSO4, 150 µM KH2PO4, 50 µM Na2HPO4, 1.0 mM CaCl2, 0.7 mM NaHCO3. Adjust pH to 7.2 to 7.4 using 2 N hydrochloric acid. Filter sterilize. Stored at room temperature for a maximum of two weeks.