Коллекция гамет и экстракорпоральное оплодотворение Astyanax mexicanus
Summary
Экстракорпоральное оплодотворение является широко используемой техникой с различными модельными организмами для поддержания популяций лабораторий и производства синхронизированных эмбрионов для применения ниже по течению. Здесь мы представляем протокол, который реализует эту технику для различных популяций мексиканской рыбы тетра, Astyanax mexicanus.
Abstract
Astyanax mexicanus становится образцовым организмом для различных исследовательских областей в биологической науке. Часть недавнего успеха этого вида телеост ных рыб является то, что он обладает межплодной пещеры и речной обитаемой популяции. Это позволяет генетическое отображение наследственных признаков, которые были зафиксированы во время адаптации к различным средам этих популяций. Хотя этот вид может быть сохранен и выведен в лаборатории, это сложно как получить эмбрионы в дневное время и создать гибридные эмбрионы между штаммами. Экстракорпоральное оплодотворение (ЭКО) было использовано с различными модельными организмами для успешного и многократного разведения животных в лаборатории. В этом протоколе мы показываем, как, акклиматизируя A. mexicanus к различным световым циклам в сочетании с изменениями температуры воды, мы можем перенести циклы размножения в выбранное время суток. Впоследствии мы покажем, как определить подходящую родительскую рыбу, собрать здоровых гамет у самцов и самок, а также производить жизнеспособное потомство с помощью ЭКО. Это позволяет проводить соответствующие процедуры, такие как инъекция генетических конструкций или анализ развития в обычное рабочее время. Кроме того, этот метод может быть использован для создания гибридов между пещерными и поверхностными популяциями, и тем самым позволит изучать генетическую основу фенотипической адаптации к различным средам.
Introduction
В последние годы, Astyanax mexicanus стал образцовым организмом в различных областях, таких как биология развития, эволюционная биология, поведенческая биология, и физиология1,2,3,4 . Уникальность этой системы исходит от этого вида, имеющего несколько морфотипов, которые адаптировались к очень разным средам. Поверхностный морфотип жилища обитает в реках, где существует высокое биоразнообразие и много источников пищи для рыб. В отличие от пещеры морфотипов A. mexicanus, пещеры, живут в пещерах, где биоразнообразие, источники пищи, и кислород резко уменьшилась1. Пещерные рыбы отличаются от поверхностных рыб различными фенотипами, такими как отсутствие глаз ипигментации, резистентность к инсулину, и способность хранить жир 2,3,4. Однако поверхностные рыбы и пещерные рыбы по-прежнему принадлежат к одному и тому же виду и, следовательно, являются взаимоплодными.
Для обоих морфотипов был определен набор условий, позволяющихпроводить плановое техническое обслуживание и разведение в лабораторных условиях 5,6. Тем не менее, генетические модификации, надлежащие эмбриональные исследования развития, и создание гибридов по-прежнему сложной задачей по нескольким причинам. A. mexicanus в основном порождается в ночные часы, что неудобно для последующих экспериментов на ранних эмбриональных стадиях, таких как инъекция генетических конструкций или мониторинг ранних эмбриональных процессов развития. Кроме того, генерация поверхностных и пещерных гибридов является сложной задачей с использованием естественного нереста, так как пещерные морфотипы имеют измененный циркадный ритм7, который в конечном счете влияет на выработку жизнеспособной яйцы. Успешные, но инвазивные, процедуры ЭКО были описаны для других видов Astyanax, где производство гамет и нереста поведение было загрунтовано с помощью гормональных инъекций8,9. Менее инвазивные процедуры ЭКО (т.е. получение гамет от ручного нереста без инъекции гормональных препаратов) были описаны, но не учитывают различия в цикле нереста между пещерными и поверхностными морфотипами A. mexicanus 6.
Другие организмы модели рыб, такие как зебра, могут быть легко генетически модифицированы и изучены на эмбриональном уровне, потому что препятствия, изложенные выше, были успешно решены. Внедрение стандартизированных методов размножения, экстракорпоральное оплодотворение и криоконсервация спермы продвинули зебры вперед и укрепило использование модели в биологических науках10. Таким образом, распространение этих методов на A. mexicanus будет еще больше укрепить его в качестве модели системы.
Здесь мы представляем подробный протокол для ЭКО, который поможет сделать A. mexicanus более доступным. Мы представим установку разведения, которая позволяет смещать световые циклы рыбы с дневного на ночное время, чтобы жизнеспособная яйца могла быть получена в дневные часы без инъекций гормональных препаратов. Затем мы предоставляем подробное описание того, как получить яйец и milt используется для ЭКО. Этот метод позволит вырабатывать эмбрионы в обычное рабочее время и сделает более возможнымприменение по сравнению с использованием эмбрионов при естественном нересте.
Protocol
Representative Results
Discussion
Хотя ЭКО является стандартизированным методом для многих различных типовых организмов, таких как зебрафиш, существующие протоколы для A. mexicanus не принимают во внимание, что этот вид естественным образом нерестится в ночные часы6. Учитывая, что пещерные рыбы и поверхнос…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить Филиппа Ногеру и Кимберли Блэнд за поддержку в видеопродукции. Авторы также хотели бы отметить всю команду водных видов спорта Института Stowers для животноводства. Эта работа была поддержана институциональным финансированием DPB и NR. NR была поддержана Фондом Эдварда Маллинкродата и JDRF. РП была поддержана грантом от Deutsche Forschungsgemeinschaft (PE 2807/1-1).
Materials
| 0.6 mL Centrifuge Tube | Eppendorf | #22364111 | |
| 100 mm Petri Dishes | VWR International | #25384-302 | |
| Aspirator Tube | Drummond | #2-000-000 | |
| Calibrated 1-5 µL Capillary Tubes | Drummond | #2-000-001 | |
| Dispolable Spatulas | VWR International | #80081-188 | |
| HMA-50S 50W Aquatic Heaters | Finnex | HMA-50S | |
| P1000 Pipette | Eppendorf | #3123000063 | |
| P1000 Pipette Tips | Thermo Scientific | #2079E | |
| Sanyo MIR-554 incubator | Panasonic Health Care | MIR-554-PA | |
| Sperm Extender E400 | 130 mM KCl, 50 mM NaCl, 2 mM CaCl2 (2H2O), 1 mM MgSO4 (7H2O), 10 mM D (+)-Glucose, 30 mM HEPES Adjust to pH 7.9 with 5M KOH and filter sterilize. Solution can be stored at 4 ˚C for up to 6 months. |
||
| Sponge Animal Holder | Made from scrap foam | ||
| System Water | Deionized water supplemented with Instant Ocean Sea Salt [Blacksburg, VA] to reach a specific conductance of 800 µS/cm. Water quality parameters are maintained within safe limits (Upper limit of total ammonia nitrogen range, 1 mg/L; upper limit of nitrite range, 0.5 mg/L; upper limit of nitrate range, 60 mg/L; temperature, 22 °C; pH, 7.65; dissolved oxygen 100 %) | ||
| Tissue Wipes | Kimberly-Clark Professional | #21905-026 | |
| ZIRC E2 Embryo Media | 15 mM NaCl, 0.5 mM KCl, 1.0 mM MgSO4, 150 µM KH2PO4, 50 µM Na2HPO4, 1.0 mM CaCl2, 0.7 mM NaHCO3. Adjust pH to 7.2 to 7.4 using 2 N hydrochloric acid. Filter sterilize. Stored at room temperature for a maximum of two weeks. |
References
- Jeffery, W. R. Regressive evolution in Astyanax cavefish. Annual Review Genetics. 43, 25-47 (2009).
- Gross, J. B., Borowsky, R., Tabin, C. J. A novel role for Mc1r in the parallel evolution of depigmentation in independent populations of the cavefish Astyanax mexicanus. PLoS Genetics. 5, e1000326 (2009).
- Riddle, M. R., et al. Insulin resistance in cavefish as an adaptation to a nutrient-limited environment. Nature. 555, 647-651 (2018).
- Xiong, S., Krishnan, J., Peuß, R., Rohner, N. Early adipogenesis contributes to excess fat accumulation in cave populations of Astyanax mexicanus. Biologie du développement. 441 (2), 297-304 (2018).
- Borowsky, R. Breeding Astyanax mexicanus through Natural Spawning. COLD SPRING HARBOR Protocols. , (2008).
- Borowsky, R. In Vitro Fertilization of Astyanax mexicanus. COLD SPRING HARBOR Protocols. , (2008).
- Beale, A., et al. Circadian rhythms in Mexican blind cavefish Astyanax mexicanus in the lab and in the field. Nature Communications. 4, 2769 (2013).
- Sato, Y., Sampaio, E. V., Fenerich-Verani, N., Verani, J. R. Reproductive biology and induced breeding of two Characidae species (Osteichthyes, Characiformes) from the São Francisco River basin, Minas Gerais, Brazil. Revista Brasileira Zoology. 23 (1), 267-273 (2006).
- Yasui, G. S., et al. Improvement of gamete quality and its short-term storage: an approach for biotechnology in laboratory fish. Animal. 9 (3), 464-470 (2015).
- Westerfield, M. . The zebrafish book : a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Simon, V., Hyacinthe, C., Retaux, S. Breeding behavior in the blind Mexican cavefish and its river-dwelling conspecific. PLoS One. 14 (2), e0212591 (2019).
- Borowsky, R. Determining the Sex of Adult Astyanax mexicanus. COLD SPRING HARBOR Protocols. , (2008).
- Ross, L. G., Ross, B. . Anaesthetic and Sedative Techniques for Aquatic Animals. , (2008).
- Matthews, J. L., et al. Changes to Extender, Cryoprotective Medium, and In Vitro Fertilization Improve Zebrafish Sperm Cryopreservation. Zebrafish. 15 (3), 279-290 (2018).
- Stahl, B. A., et al. Stable transgenesis in Astyanax mexicanus using the Tol2 transposase system. Developmental Dynamics. , 1-9 (2019).
- Elipot, Y., Legendre, L., Pere, S., Sohm, F., Retaux, S. Astyanax transgenesis and husbandry: how cavefish enters the laboratory. Zebrafish. 11, 291-299 (2014).
- Gross, J. B., Borowsky, R., Tabin, C. J. A novel role for Mc1r in the parallel evolution of depigmentation in independent populations of the cavefish Astyanax mexicanus. PLoS Genetics. 5 (1), e1000326 (2009).
- Jeffery, W. R. Chapter 8. Evolution and development in the cavefish Astyanax. Current Topics in Developmental Biology. 86, 191-221 (2009).
- Protas, M., Conrad, M., Gross, J. B., Tabin, C., Borowsky, R. Regressive evolution in the Mexican cave tetra, Astyanax mexicanus. Current Biology. 17 (5), 452-454 (2007).
- Hinaux, H., et al. A developmental staging table for Astyanax mexicanus surface fish and Pachon cavefish. Zebrafish. 8, 155-165 (2011).
- Draper, B. W., Moens, C. B. A high-throughput method for zebrafish sperm cryopreservation and in vitro fertilization. Journal of Visualized Experiment. (29), (2009).
