Gamete koleksiyonu ve Astyanax mexicanus In vitro fertilizasyon
Summary
In vitro fertilizasyon, laboratuvar nüfusunu korumak ve akım uygulamaları için senkronize embriyolar üretmek için çeşitli model organizmalar ile yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. Burada, biz Meksika Tetra balık, Astyanax mexicanusfarklı nüfusu için bu tekniği uygulayan bir protokol sunuyoruz.
Abstract
Astyanax mexicanus biyolojik bilimin çeşitli araştırma alanları için bir model organizma olarak ortaya çıkmaktadır. Bu teleost balık türlerinin son başarının bir parçası, interfertaş mağara ve nehir-konut nüfusu sahip olmasıdır. Bu, bu nüfusun farklı ortamlarda adaptasyon sırasında sabit kalıtsal özelliklerin genetik haritalama sağlar. Bu tür laboratuarda muhafaza edilebilir ve yetiştirilen iken, hem gündüz embriyolar elde etmek ve suşları arasında hibrid embriyo oluşturmak için zordur. In vitro fertilizasyon (ıVF), laboratuvardaki hayvanları başarıyla ve tekrar tekrar doğurmak için farklı model organizmaların çeşitliliği ile kullanılmıştır. Bu protokolde, biz göstermek nasıl, a. mexicanus tarafından farklı ışık döngüleri su sıcaklığında değişiklikler ile birleştiğinde için, biz günün seçilmiş bir zamana üreme döngüleri vardiya olabilir. Daha sonra, uygun ebeveyn balıklarını nasıl tespit ettiğimizi, erkek ve dişilerden sağlıklı gamet toplamaya ve ıVF kullanarak uygulanabilir yavruları üretmeyi gösteriyoruz. Bu, normal çalışma saatlerinde ortaya çıkan genetik yapıların veya gelişimsel analizlerin enjekte edilmesi gibi ilgili prosedürler sağlar. Ayrıca, bu teknik mağara ve yüzey konut nüfus arasında melez oluşturmak için kullanılabilir, ve böylece farklı ortamlar için fenotipi adaptasyon genetik temeli çalışma sağlar.
Introduction
Son yıllarda, Astyanax mexicanus gelişimsel biyoloji, Evrimsel biyoloji, davranışsal biyoloji ve Fizyoloji1,2,3,4 gibi farklı alanlarda bir model organizma haline gelmiştir . Bu sistemin benzersizliği çok farklı ortamlarda adapte olan birkaç Morfotiplerin sahip bu tür gelir. Yüzey konut morphotype yüksek biyoçeşitlilik ve balık için gıda kaynaklarının bol olduğu nehirlerde yaşıyor. Buna karşılık, A. mexicanusmağara Morfotiplerin, cavefish, biyolojik çeşitlilik, gıda kaynakları ve oksijen büyük ölçüde azalır mağaralarda yaşıyor1. Cavefish göz ve pigmentasyon yokluğu, insülin direnci ve yağ2,3,4saklamak için yeteneği gibi fenotipleri çeşitli yüzey balık farklıdır. Bununla birlikte, yüzey balığı ve gizliyor hala aynı türe aittir ve bu nedenle, interferon.
Hem morphotypes için, koşullar bir dizi rutin bakım ve üreme laboratuvar koşulları altında izin vermek için tanımlanmıştır5,6. Ancak, genetik değişiklikler, uygun embriyonik gelişimsel çalışmalar, ve melezlerin oluşturulması hala çeşitli nedenlerle zor. A. mexicanus öncelikle genetik yapıları enjeksiyon veya erken embriyonik gelişimsel süreçlerin izlenmesi gibi erken embriyonik aşamalarında sonraki deneyler için uygunsuz olan gece saatlerinde spawn. Buna ek olarak, yüzey ve mağara melez nesil doğal yumurtlama kullanarak zorlu, mağara Morfotiplerin değiştirilmiş bir sirkadiyen ritmi var beri7 sonuçta uygulanabilir ova üretimini etkiler. Başarılı, ancak invaziv, IVF prosedürleri diğer astyanax türleri için tarif edilmiştir, burada gamet üretim ve yumurtlama davranışı Hormonal enjeksiyonları kullanılarak astarlanmış olduğu,8,9. Daha az invaziv IVF prosedürleri (yani, hormonal preparatlar enjeksiyon olmadan manuel yumurtlama gamet elde) tarif edilmiştir ama mağara ve A. mexicanus yüzey Morfotiplerin arasındaki yumurtlama döngüsü farklılıkları dikkate almaz 6‘ ya kadar.
Diğer balık modeli organizmalar, zebrafish gibi, kolayca genetik olarak değiştirilebilir ve bir embriyonik düzeyde incelenebilir çünkü engelleri yukarıda belirtilen başarıyla çözüldü. Standartlaştırılmış üreme tekniklerinin uygulanması, in vitro fertilizasyon, ve sperm ağaloprezervasyon tüm zebra balığı ileri itti ve biyolojik bilimler modeli kullanımı katılaşmış10. Bu nedenle, bir. mexicanus bu teknikleri genişletmek daha bir model sistemi olarak güçlendirecektir.
Burada, biz a. mexicanus daha erişilebilir hale getirmek için yardımcı olacak IVF için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Biz uygun ova hormonal preparatlar enjeksiyon olmadan gün boyunca elde edilebilir, böylece gündüz geceleri balık ışık döngüleri kayması sağlayan bir üreme kurulum sunacak. Daha sonra ıVF için kullanılan ova ve Milt elde etmek için nasıl ayrıntılı bir açıklama sağlar. Bu yöntem normal çalışma saatleri boyunca embriyolar üretimini sağlayacak ve doğal yumurtlama embriyoları kullanarak daha fazla aşağı aşağı uygulamaları daha uygun hale getirmek.
Protocol
Representative Results
Discussion
IVF zebrafish gibi birçok farklı model organizmalar için standartlaştırılmış bir yöntemdir iken, a. mexicanus için mevcut protokoller bu türün doğal olarak gece saat6sırasında yumurtalar dikkate almaz. Bu gizliyor ve yüzey balıklarının sirkadiyen ritimleri oldukça büyük ölçüde farklılık göz önüne alındığında, ova olgunlaşma döngüsü de mağara ve yüzey morphotypes arasında farklılık gösterir. A. mexicanus yüzeyi için hazırlama sıcakl?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar video üretim desteği için Philippe Noguera ve Kimberly Bland teşekkür etmek istiyorum. Yazarlar aynı zamanda hayvancılığa yönelik Stowers Enstitüsü ‘nün tüm Aquatics takımını kabul etmek ister. Bu çalışma DPB ve NR ‘a kurumsal finansman tarafından destekleniyordu. NR, Edward Mallinckrodt Vakfı ve JDRF tarafından destekleniyordu. RP, Deutsche Forschungsgemeinschaft ‘dan (PE 2807/1-1) bir hibe tarafından destekleniyordu.
Materials
| 0.6 mL Centrifuge Tube | Eppendorf | #22364111 | |
| 100 mm Petri Dishes | VWR International | #25384-302 | |
| Aspirator Tube | Drummond | #2-000-000 | |
| Calibrated 1-5 µL Capillary Tubes | Drummond | #2-000-001 | |
| Dispolable Spatulas | VWR International | #80081-188 | |
| HMA-50S 50W Aquatic Heaters | Finnex | HMA-50S | |
| P1000 Pipette | Eppendorf | #3123000063 | |
| P1000 Pipette Tips | Thermo Scientific | #2079E | |
| Sanyo MIR-554 incubator | Panasonic Health Care | MIR-554-PA | |
| Sperm Extender E400 | 130 mM KCl, 50 mM NaCl, 2 mM CaCl2 (2H2O), 1 mM MgSO4 (7H2O), 10 mM D (+)-Glucose, 30 mM HEPES Adjust to pH 7.9 with 5M KOH and filter sterilize. Solution can be stored at 4 ˚C for up to 6 months. |
||
| Sponge Animal Holder | Made from scrap foam | ||
| System Water | Deionized water supplemented with Instant Ocean Sea Salt [Blacksburg, VA] to reach a specific conductance of 800 µS/cm. Water quality parameters are maintained within safe limits (Upper limit of total ammonia nitrogen range, 1 mg/L; upper limit of nitrite range, 0.5 mg/L; upper limit of nitrate range, 60 mg/L; temperature, 22 °C; pH, 7.65; dissolved oxygen 100 %) | ||
| Tissue Wipes | Kimberly-Clark Professional | #21905-026 | |
| ZIRC E2 Embryo Media | 15 mM NaCl, 0.5 mM KCl, 1.0 mM MgSO4, 150 µM KH2PO4, 50 µM Na2HPO4, 1.0 mM CaCl2, 0.7 mM NaHCO3. Adjust pH to 7.2 to 7.4 using 2 N hydrochloric acid. Filter sterilize. Stored at room temperature for a maximum of two weeks. |
References
- Jeffery, W. R. Regressive evolution in Astyanax cavefish. Annual Review Genetics. 43, 25-47 (2009).
- Gross, J. B., Borowsky, R., Tabin, C. J. A novel role for Mc1r in the parallel evolution of depigmentation in independent populations of the cavefish Astyanax mexicanus. PLoS Genetics. 5, e1000326 (2009).
- Riddle, M. R., et al. Insulin resistance in cavefish as an adaptation to a nutrient-limited environment. Nature. 555, 647-651 (2018).
- Xiong, S., Krishnan, J., Peuß, R., Rohner, N. Early adipogenesis contributes to excess fat accumulation in cave populations of Astyanax mexicanus. Biologie du développement. 441 (2), 297-304 (2018).
- Borowsky, R. Breeding Astyanax mexicanus through Natural Spawning. COLD SPRING HARBOR Protocols. , (2008).
- Borowsky, R. In Vitro Fertilization of Astyanax mexicanus. COLD SPRING HARBOR Protocols. , (2008).
- Beale, A., et al. Circadian rhythms in Mexican blind cavefish Astyanax mexicanus in the lab and in the field. Nature Communications. 4, 2769 (2013).
- Sato, Y., Sampaio, E. V., Fenerich-Verani, N., Verani, J. R. Reproductive biology and induced breeding of two Characidae species (Osteichthyes, Characiformes) from the São Francisco River basin, Minas Gerais, Brazil. Revista Brasileira Zoology. 23 (1), 267-273 (2006).
- Yasui, G. S., et al. Improvement of gamete quality and its short-term storage: an approach for biotechnology in laboratory fish. Animal. 9 (3), 464-470 (2015).
- Westerfield, M. . The zebrafish book : a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Simon, V., Hyacinthe, C., Retaux, S. Breeding behavior in the blind Mexican cavefish and its river-dwelling conspecific. PLoS One. 14 (2), e0212591 (2019).
- Borowsky, R. Determining the Sex of Adult Astyanax mexicanus. COLD SPRING HARBOR Protocols. , (2008).
- Ross, L. G., Ross, B. . Anaesthetic and Sedative Techniques for Aquatic Animals. , (2008).
- Matthews, J. L., et al. Changes to Extender, Cryoprotective Medium, and In Vitro Fertilization Improve Zebrafish Sperm Cryopreservation. Zebrafish. 15 (3), 279-290 (2018).
- Stahl, B. A., et al. Stable transgenesis in Astyanax mexicanus using the Tol2 transposase system. Developmental Dynamics. , 1-9 (2019).
- Elipot, Y., Legendre, L., Pere, S., Sohm, F., Retaux, S. Astyanax transgenesis and husbandry: how cavefish enters the laboratory. Zebrafish. 11, 291-299 (2014).
- Gross, J. B., Borowsky, R., Tabin, C. J. A novel role for Mc1r in the parallel evolution of depigmentation in independent populations of the cavefish Astyanax mexicanus. PLoS Genetics. 5 (1), e1000326 (2009).
- Jeffery, W. R. Chapter 8. Evolution and development in the cavefish Astyanax. Current Topics in Developmental Biology. 86, 191-221 (2009).
- Protas, M., Conrad, M., Gross, J. B., Tabin, C., Borowsky, R. Regressive evolution in the Mexican cave tetra, Astyanax mexicanus. Current Biology. 17 (5), 452-454 (2007).
- Hinaux, H., et al. A developmental staging table for Astyanax mexicanus surface fish and Pachon cavefish. Zebrafish. 8, 155-165 (2011).
- Draper, B. W., Moens, C. B. A high-throughput method for zebrafish sperm cryopreservation and in vitro fertilization. Journal of Visualized Experiment. (29), (2009).
