Gamete Collection und In-Vitro-Fertilisation von Astyanax mexicanus

Summary

Die In-vitro-Fertilisation ist eine häufig verwendete Technik mit einer Vielzahl von Modellorganismen, um Laborpopulationen zu erhalten und synchronisierte Embryonen für nachgelagerte Anwendungen zu produzieren. Hier präsentieren wir ein Protokoll, das diese Technik für verschiedene Populationen des mexikanischen Tetrafisches Astyanax mexicanusumsetzt.

Abstract

Astyanax mexicanus entwickelt sich zu einem Modellorganismus für eine Vielzahl von Forschungsbereichen in der biologischen Wissenschaft. Ein Teil des jüngsten Erfolgs dieser Teleostfischart ist, dass sie interfertile Höhlen- und Flusspopulationen besitzt. Dies ermöglicht die genetische Kartierung vererbbarer Merkmale, die während der Anpassung an die verschiedenen Umgebungen dieser Populationen fixiert wurden. Während diese Art im Labor gepflegt und gezüchtet werden kann, ist es schwierig, sowohl Embryonen während des Tages zu erhalten und Hybridembryonen zwischen Stämmen zu erzeugen. Die In-vitro-Fertilisation (IVF) wurde mit einer Vielzahl unterschiedlicher Modellorganismen eingesetzt, um Tiere im Labor erfolgreich und wiederholt zu züchten. In diesem Protokoll zeigen wir, wie wir durch die Akklimatisierung von A. mexicanus an verschiedene Lichtzyklen gekoppelt mit Veränderungen der Wassertemperatur Brutzyklen auf eine gewählte Tageszeit verschieben können. Anschließend zeigen wir, wie man geeignete Elternfische identifiziert, gesunde Gameten von Männchen und Weibchen sammelt und mit IVF lebensfähige Nachkommen produziert. Dies ermöglicht verwandte Verfahren wie die Injektion von genetischen Konstrukten oder Entwicklungsanalysen während der normalen Arbeitszeit. Darüber hinaus kann diese Technik verwendet werden, um Hybriden zwischen der Höhle und oberflächenbewohnenden Populationen zu schaffen und so die Erforschung der genetischen Grundlagen phäkotypischer Anpassungen an unterschiedliche Umgebungen zu ermöglichen.

Introduction

In den letzten Jahren hat sich Astyanax mexicanus zu einem Modellorganismus in verschiedenen Bereichen wie Entwicklungsbiologie, Evolutionsbiologie, Verhaltensbiologie und Physiologie^1,2,3,4 . Die Einzigartigkeit dieses Systems kommt von dieser Art mit mehreren Morphotypen, die sich an sehr unterschiedliche Umgebungen angepasst haben. Der Oberflächen-Morphotyp lebt in Flüssen, wo es eine hohe Artenvielfalt und viele Nahrungsquellen für die Fische gibt. Im Gegensatz dazu leben die Höhlenmorphotypen von A. mexicanus, dem Höhlenfisch, in Höhlen, in denen Artenvielfalt, Nahrungsquellen und Sauerstoff drastisch reduziert werden¹. Höhlenfische unterscheiden sich von den Oberflächenfischen in einer Vielzahl von Phänotypen wie das Fehlen von Augen und Pigmentierung, Insulinresistenz, und die Fähigkeit, Fett zu speichern^2,3,4. Oberflächenfische und Höhlenfische gehören jedoch immer noch zu denselben Arten und sind daher interfertile.

Für beide Morphotypen wurde eine Reihe von Bedingungen definiert, um routinemäßige Wartung und Züchtung unter Laborbedingungen^5,6zu ermöglichen. Genetische Veränderungen, richtige embryonale Entwicklungsstudien und die Kreation von Hybriden sind jedoch aus mehreren Gründen immer noch eine Herausforderung. A. Mexicanus laichen in erster Linie in den Nachtstunden, was für nachfolgende Experimente an frühen embryonalen Stadien wie der Injektion genetischer Konstrukte oder der Überwachung früher embryonaler Entwicklungsprozesse unbequem ist. Darüber hinaus ist die Erzeugung von Oberflächen- und Höhlenhybriden mit natürlichem Laichen eine Herausforderung, da die Höhlenmorphotypen einen veränderten zirkadianen Rhythmus⁷ haben, der letztlich die Produktion lebensfähiger Eizellen beeinflusst. Erfolgreiche, aber invasive IVF-Verfahren wurden für andere Astyanax-Arten beschrieben, bei denen Die Gametenproduktion und das Laichverhalten mit hormonellen Injektionen^8,9grundiert wurde. Weniger invasive IVF-Verfahren (d. h. die Gewinnung von Gameten aus dem manuellen Laichen ohne Injektion von hormonellen Präparaten) wurden beschrieben, berücksichtigen jedoch nicht die Unterschiede im Laichzyklus zwischen Höhlen- und Oberflächenmorphotypen von A. mexicanus ⁶.

Andere Fischmodellorganismen, wie der Zebrafisch, können leicht gentechnisch verändert und auf embryonaler Ebene untersucht werden, da die oben genannten Hindernisse erfolgreich gelöst wurden. Die Implementierung standardisierter Züchtungstechniken, in vitro Fertilisation und Spermienkryokonservierung haben Zebrafische nach vorne getrieben und den Einsatz des Modells in den biologischen Wissenschaften verfestigt¹⁰. Daher wird die Ausweitung dieser Techniken auf A. mexicanus sie als Modellsystem weiter stärken.

Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll für IVF vor, das dazu beitragen wird, A. mexicanus zugänglicher zu machen. Wir werden ein Zucht-Setup vorstellen, das es ermöglicht, die Lichtzyklen der Fische von Tag zu Nacht zu verschieben, so dass lebensfähige Eizellen während der Tagesstunden ohne Injektion von hormonellen Präparaten erhalten werden können. Wir bieten dann eine detaillierte Beschreibung, wie man die Eizellen und milt für IVF verwendet zu erhalten. Diese Methode wird die Erzeugung von Embryonen während der normalen Arbeitszeit ermöglichen und weitere nachgelagerte Anwendungen im Vergleich zur Verwendung von Embryonen aus natürlichem Laichverfahren erleichterbarer machen.

Protocol

Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) des Stowers Institute for Medical Research genehmigt. 1. Lichtzyklus-Manipulation Richten Sie Fischtanks in einem undurchsichtigen, vollständig geschlossenen (Lichtschutz) durchfließenden Aquakultursystem ein, das mehrere Tanksreihen enthält (Abbildung 1).HINWEIS: Das Influsssystem, wie in Abbildung 1 dargestellt, verwendet…

Representative Results

Das hier vorgestellte Protokoll basiert hauptsächlich auf einem zuvor veröffentlichten Protokoll6. Da A. mexicanus jedoch in den Nachtstunden laicht, haben wir ein Gehäusefürsttell für die Fischzucht entworfen, das die Photoperiode unabhängig von den Arbeitszeiten ändern kann (Abbildung 1). Der Fischlichtzyklus wird innerhalb eines vollständig geschlossenen, durchfließenden Aquakultursystems</stro…

Discussion

Während IVF eine standardisierte Methode für viele verschiedene Modellorganismen wie Zebrafische ist, berücksichtigen bestehende Protokolle für A. mexicanus nicht, dass diese Art natürlich in den Nachtstunden laicht⁶. Da sich Höhlenfische und Oberflächenfische in ihren zirkadianen Rhythmen recht stark unterscheiden, unterscheidet sich der Reifezyklus der Eizellen auch zwischen den Höhlen- und Oberflächenmorphotypen. Während die Staging-Temperaturen und -Zeiten für Oberfläche <…

Materials

0.6 mL Centrifuge Tube	Eppendorf	#22364111
100 mm Petri Dishes	VWR International	#25384-302
Aspirator Tube	Drummond	#2-000-000
Calibrated 1-5 µL Capillary Tubes	Drummond	#2-000-001
Dispolable Spatulas	VWR International	#80081-188
HMA-50S  50W Aquatic Heaters	Finnex	HMA-50S
P1000 Pipette	Eppendorf	#3123000063
P1000 Pipette Tips	Thermo Scientific	#2079E
Sanyo MIR-554 incubator	Panasonic Health Care	MIR-554-PA
Sperm Extender E400			130 mM KCl, 50 mM NaCl, 2 mM CaCl2 (2H2O), 1 mM MgSO4 (7H2O), 10 mM D (+)-Glucose, 30 mM HEPES Adjust to pH 7.9 with  5M KOH and filter sterilize. Solution can be stored at 4 ˚C for up to 6 months.
Sponge Animal Holder			Made from scrap foam
System Water			Deionized water supplemented with Instant Ocean Sea Salt [Blacksburg, VA] to reach a specific conductance of 800 µS/cm.  Water quality parameters are maintained within safe limits (Upper limit of total ammonia nitrogen range, 1 mg/L; upper limit of nitrite range, 0.5 mg/L; upper limit of nitrate range, 60 mg/L; temperature, 22 °C; pH, 7.65; dissolved oxygen 100 %)
Tissue Wipes	Kimberly-Clark Professional	#21905-026
ZIRC E2 Embryo Media			15 mM NaCl, 0.5 mM KCl, 1.0 mM MgSO4, 150 µM KH2PO4, 50 µM Na2HPO4, 1.0 mM CaCl2, 0.7 mM NaHCO3. Adjust pH to 7.2 to 7.4 using 2 N hydrochloric acid. Filter sterilize. Stored at room temperature for a maximum of two weeks.