Gamete Collection y Fertilización In Vitro de Astyanax mexicanus
Summary
La fertilización in vitro es una técnica comúnmente utilizada con una variedad de organismos modelo para mantener las poblaciones de laboratorio y producir embriones sincronizados para aplicaciones posteriores. Aquí, presentamos un protocolo que implementa esta técnica para diferentes poblaciones del tetra pescado mexicano, Astyanax mexicanus.
Abstract
Astyanax mexicanus está emergiendo como un organismo modelo para una variedad de campos de investigación en ciencia biológica. Parte del éxito reciente de esta especie de peces de teleost es que posee cuevas interferentes y poblaciones que habitan en los ríos. Esto permite el mapeo genético de rasgos hereditarios que se fijaron durante la adaptación a los diferentes ambientes de estas poblaciones. Si bien esta especie puede ser mantenida y criada en el laboratorio, es un reto obtener embriones durante el día y crear embriones híbridos entre cepas. La fertilización in vitro (FIV) se ha utilizado con una variedad de diferentes organismos modelo para criar con éxito y repetidamente animales en el laboratorio. En este protocolo, mostramos cómo, al aclimatar A. mexicanus a diferentes ciclos de luz junto con cambios en la temperatura del agua, podemos cambiar los ciclos de reproducción a una hora elegida del día. Posteriormente, mostramos cómo identificar peces parentales adecuados, recolectar gametos saludables de machos y hembras, y producir descendencia viable usando FIV. Esto permite que se produzcan procedimientos relacionados como la inyección de construcciones genéticas o el análisis del desarrollo durante las horas normales de trabajo. Además, esta técnica se puede utilizar para crear híbridos entre las poblaciones de cuevas y habitantes de superficie, y así permitir el estudio de la base genética de adaptaciones fenotípicas a diferentes ambientes.
Introduction
En los últimos años, Astyanax mexicanus se ha convertido en un organismo modelo en diferentes campos como la biología del desarrollo, la biología evolutiva, la biología conductual y la fisiología1,2,3,4 . La singularidad de este sistema proviene de que esta especie tenga varios morfotipos que se han adaptado a ambientes muy diferentes. El morfotipo de la vivienda superficial vive en ríos donde hay una alta biodiversidad y un montón de fuentes de alimento para los peces. Por el contrario, los morfotipos de la cueva de A. mexicanus,el pez cavernario, viven en cuevas donde la biodiversidad, las fuentes de alimentos y el oxígeno disminuyen drásticamente1. Los peces cavernícolas difieren de los peces de superficie en una variedad de fenotipos como la ausencia de ojos y pigmentación, resistencia a la insulina, y la capacidad de almacenar grasa2,3,4. Sin embargo, los peces de superficie y los peces cavernícolas siguen perteneciendo a la misma especie y, por lo tanto, son interferentes.
Para ambos morfotipos, se ha definido un conjunto de condiciones para permitir el mantenimiento y la cría de rutina en condicionesdelaboratorio 5,6. Sin embargo, las modificaciones genéticas, los estudios de desarrollo embrionario adecuados y la creación de híbridos siguen siendo desafiantes por varias razones. A. mexicanus desove principalmente durante las horas nocturnas, lo que es inconveniente para experimentos posteriores en etapas embrionarias tempranas como la inyección de construcciones genéticas o el monitoreo de procesos de desarrollo embrionariotemprano tempranos. Además, la generación de híbridos superficiales y de cuevas es un reto utilizando el desove natural, ya que los morfotipos de la cueva tienen un ritmo circadiano alterado7 que en última instancia afecta a la producción de óvulos viables. Se han descrito procedimientos exitosos, pero invasivos, de FIV para otras especies de Astyanax, donde la producción de gametos y el comportamiento de desove se prepararon con inyecciones hormonales8,9. Se han descrito procedimientos de FIV menos invasivos (es decir, obtención de gametos a partir de manual sin la inyección de preparaciones hormonales), pero no se tienen en cuenta las diferencias en el ciclo de desove entre los morfotipos de cueva y superficie de A. mexicanus 6.
Otros organismos modelo de peces, como el pez cebra, pueden ser fácilmente modificados genéticamente y estudiados a nivel embrionario porque los obstáculos indicados anteriormente se han resuelto con éxito. La implementación de técnicas de reproducción estandarizadas, la fertilización in vitro y la criopreservación de espermatozoides han empujado al pez cebra hacia adelante y solidificado el uso del modelo en las ciencias biológicas10. Por lo tanto, extender estas técnicas a A. mexicanus lo fortalecerá aún más como un sistema modelo.
Aquí, presentamos un protocolo detallado para la FIV que ayudará a hacer A. mexicanus más accesible. Presentaremos una configuración de cría que permite cambiar los ciclos de luz de los peces de día a noche para que se puedan obtener óvulos viables durante las horas de día sin necesidad de inyección de preparaciones hormonales. A continuación, proporcionamos una descripción detallada de cómo obtener los óvulos y milt utilizados para la FIV. Este método permitirá la producción de embriones durante las horas normales de trabajo y hará que las aplicaciones posteriores sean más factibles en comparación con el uso de embriones de desove natural.
Protocol
Representative Results
Discussion
Si bien la FIV es un método estandarizado para muchos organismos modelo diferentes como el pez cebra, losprotocolos existentes para A. mexicanus no tienen en cuenta que esta especie desove naturalmente durante las horas de la noche 6. Dado que los peces cavernarios y los peces de superficie difieren drásticamente en sus ritmos circadianos, el ciclo de maduración de los óvulos también difiere entre los morfotipos de la cueva y la superficie. Mientras que las temperaturas y tiempos de …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores quieren agradecer a Philippe Noguera y Kimberly Bland por su apoyo en la producción de vídeo. Los autores también quieren reconocer a todo el Equipo Acuático del Instituto Stowers para la cría de animales. Esta labor fue apoyada por la financiación institucional de DPB y NR. NR fue apoyado por la Edward Mallinckrodt Foundation y JDRF. RP fue apoyado por una subvención de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (PE 2807/1-1).
Materials
| 0.6 mL Centrifuge Tube | Eppendorf | #22364111 | |
| 100 mm Petri Dishes | VWR International | #25384-302 | |
| Aspirator Tube | Drummond | #2-000-000 | |
| Calibrated 1-5 µL Capillary Tubes | Drummond | #2-000-001 | |
| Dispolable Spatulas | VWR International | #80081-188 | |
| HMA-50S 50W Aquatic Heaters | Finnex | HMA-50S | |
| P1000 Pipette | Eppendorf | #3123000063 | |
| P1000 Pipette Tips | Thermo Scientific | #2079E | |
| Sanyo MIR-554 incubator | Panasonic Health Care | MIR-554-PA | |
| Sperm Extender E400 | 130 mM KCl, 50 mM NaCl, 2 mM CaCl2 (2H2O), 1 mM MgSO4 (7H2O), 10 mM D (+)-Glucose, 30 mM HEPES Adjust to pH 7.9 with 5M KOH and filter sterilize. Solution can be stored at 4 ˚C for up to 6 months. |
||
| Sponge Animal Holder | Made from scrap foam | ||
| System Water | Deionized water supplemented with Instant Ocean Sea Salt [Blacksburg, VA] to reach a specific conductance of 800 µS/cm. Water quality parameters are maintained within safe limits (Upper limit of total ammonia nitrogen range, 1 mg/L; upper limit of nitrite range, 0.5 mg/L; upper limit of nitrate range, 60 mg/L; temperature, 22 °C; pH, 7.65; dissolved oxygen 100 %) | ||
| Tissue Wipes | Kimberly-Clark Professional | #21905-026 | |
| ZIRC E2 Embryo Media | 15 mM NaCl, 0.5 mM KCl, 1.0 mM MgSO4, 150 µM KH2PO4, 50 µM Na2HPO4, 1.0 mM CaCl2, 0.7 mM NaHCO3. Adjust pH to 7.2 to 7.4 using 2 N hydrochloric acid. Filter sterilize. Stored at room temperature for a maximum of two weeks. |
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