Lhgra 介导的反激活在拟南芥诱导、细胞类型特异性表达中的表达
Summary
在这里, 我们描述了一组转基因拟南芥系的产生和应用, 使诱导, 组织特异性表达在三个主要分生组织, 芽顶端分生组织, 根顶端分生组织, 和半位子。
Abstract
诱导的组织特异性表达式是研究遗传扰动时空动力学的重要而有力的工具。结合灵活高效的 GreenGate 克隆系统与经过验证的 LhGR 系统 (此处称为 GR-LHG4) 进行诱导表达, 我们生成了一组可驱动效应器表达的转基因拟南芥线盒式磁带在三个主要植物分生组织中的一系列特定细胞类型。为此, 我们选择了以前开发的 Gr-lhg4 系统, 该系统基于嵌合转录因子和同源POp-type 启动子,确保对广泛的表达水平进行严格控制。此外, 为了可视化合成转录因子处于活动状态的表达域, 在Pop4 或 POp4启动子的控制下, 将一个 er 局部的 mTurquoise2 荧光记者编码为驱动程序行。在这里, 我们描述了生成驱动程序或效应线所需的步骤, 并演示了如何诱导和跟踪细胞类型的特异性表达, 在芽顶端分生组织, 根顶端分生组织和拟南芥的形成层。通过使用多个或所有驱动线, 可以快速评估在合成Pop启动子控制下表达一个或多个因素 (效应器) 的特定上下文效果, 例如在一个效应器和多个效应器之间交叉的 f1 工厂中驱动程序行。这种方法的例子是 VND7 的异位表达, NAC 转录因子能够诱导异位继发性细胞壁沉积在细胞自主的方式。
Introduction
后基因组时代生物学的一个主要局限性是破译特定因素或遗传扰动的上下文特定角色。功能丧失和功能增益方法等本构遗传扰动往往只允许对终身适应过程进行终点分析, 混淆了主要效应和次要效应之间的区别。此外, 特定于上下文的功能可以被远处组织或其他发育阶段的大规模影响所掩盖或稀释。此外, 在极端情况下, 杀伤力可以排除任何机械洞察。理想的情况是, 为了避免这些问题, 人们可以分析急性遗传扰动在特定上下文中的影响, 例如以时间解析的方式处理特定的细胞类型。为了实现这一目标, 需要为诱导、细胞类型特异性表达的遗传工具1。为了提供一个资源, 快速评估对特定效应的反应的时空动态, 我们将 GreenGate 系统2提供的克隆的易用性与 Gr-lhg4 系统3的公认有效性结合起来, 4,5,6。在特征良好的细胞类型特异性启动子8的控制下, 我们产生了一组表达嵌合转录因子 LhG4 融合到大鼠皮质激素受体 (GR)7配体结合域的线.在静止状态下, 转录因子仍保留在细胞核之外, 因为 GR 域受细胞质 HSP90 的约束。加入合成配体地塞米松 (Dex) 后, 介导核转移, LhG4 在同源合成 POp-type型启动子 (如 mTurquoise2 记者) 的控制下, 对表达盒进行介导转录包含在驱动程序行中, 以可视化归纳后的表达域。 因此, 从技术上讲, 驱动线还包含一个效应盒。通过将一组带有效应盒的线路交叉, 例如, 在同一p p 型启动子的控制下建立感兴趣的基因, 从而能够快速评估效应表达的急性或长期后果在广泛的细胞类型。
在这里, 我们提供了一个协议, 描述了生成驱动程序和效应线所需的过程, 并演示了如何在芽顶端分生组织、根根顶端分生组织和形成层中诱导和遵循细胞类型的特定表达式。拟 南 芥。为了说明这种方法的能力和特异性, 我们使用了众所周知的转录因子 VND7, 它能够驱动类似二甲苯的二级细胞壁增厚外翻 9.从pSCR10、11驱动线和popo6:vnd7 效应线之间的交叉处理 f1, 导致拟南芥茎淀粉鞘细胞中异位木质样细胞的形成。
为了便于生成构建驱动程序和效应表达质粒所需的大型 DNA 组件, 我们采用了快速高效的 GreenGate 克隆方法2。GreenGate 克隆基于 II 型 S 限制性酶, 如eco31i 或其等分裂体bsai2。这些酶在其不对称识别部位下游切割, 产生不同碱基成分的悬垂。通过将eco31/bsai 限制位点纳入寡核苷酸, 并将特定的悬垂序列分配给 dna 元素, 实现了模块化克隆, 从而促进了大型组件的生成。在 GreenGate 框架中, DNA 模块属于 A-F 类, 基于悬垂序列, 作为适配器并按这个顺序组装。因此, 设计用于放大所需产品的引物应符合所选模块2 (图 1a)。如果有内部的 eco31/Bsa i站点, 并且序列与 greengate 入口和目标模块不兼容, 则可以在不进行突变但效率较低的情况下继续进行。或者, 使用位点定向诱变去除生态 31/Bsa i 限制位点注意不要改变基因产品中的氨基酸.
Protocol
Representative Results
Discussion
在这里, 我们描述了生成和应用用于诱导、细胞类型特异性反激活的多功能和全面工具包所需的步骤。在Pop启动子的控制下, 通过携带效应盒的交叉线, 可以研究 f1 一代的误报效应, 从而能够在广泛的细胞类型中快速评估遗传扰动。或者, 效应器构造可用于转换驱动线, 或者通过调整克隆策略, 也可以将驱动程序和效应器构造组合在一个 T-DNA 上。该系统的应用范围从空间和时间控制的误…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们实验室的工作得到德国研究基金会 (DFG) 赠款 wo 16606-1 (至 s. w.) 的支持.) 和 GR 2104 4-1 (至 t. g.) 和 SFB1101 (至 t. g. 和 j. u. l), 以及欧洲研究理事会向 t. g. 提供的合并赠款 (PLANSTEMS 647148)。 S. w. 通过 Dfg 的 Emmy Noether 研究金通过 Grant WO 1660/得到支持。
Materials
| Ampicillin | Carl Roth GmbH + Co. KG | K029.1 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C1919 | |
| Column purification | Qiagen | QIAquick PCR Purification Kit (250) | |
| Culture chamber for imaging | Sarstedt AG & Co. KG | 1-well tissue culture chamber, on cover glass II | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4903 | |
| DMSO | Fisher Scientific, UK | D139-1 | |
| Eco31I | Thermo Fisher Scientific | FD0294 | |
| injection cannula (0.30 x 12 mm, 30 G x 1/2) | Sterican, Braun | ||
| Kanamycin | Carl Roth GmbH + Co. KG | T832.2 | |
| Leica TCS SP5 CLSM, HCX PL APO lambda blue 63x water immersion objectiv | Leica, Wetzlar, Germany | ||
| MS medium | Duchefa, Haarlem, Netherlands | M0221.0050 | |
| Nikon A1 CLSM, Apo LWD 25x 1.1 NA water immersion objective | Nikon, Minato, Tokyo, Japan | ||
| Petri dish 35/10 mm | Greiner Bio-One GmbH, Germany | 627102 | |
| Petri dish 60/150 mm | Greiner Bio-One GmbH, Germany | 628102 | |
| Petri dish 120/120/17 | Greiner Bio-One GmbH, Germany | 688102 | |
| Plant agar | Duchefa, Haarlem, Netherlands | P1001 | |
| Plasmid extraction | Qiagen | QIAprep Spin Miniprep Kit | |
| Propidium iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | |
| Razorblade | Classic, Wilkinson Sword GmbH | 7005115E | |
| Reaction tubes | Sarstedt AG & Co. KG | 72.690.001 | |
| Silwet L-77 | Kurt Obermeier GmbH & Co. KG, Bad Berleburg, Germany | ||
| Spectinomycin | AppliChem GmbH | 3834.001 | |
| Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | NanoDrop 2000c | |
| Sucrose | Carl Roth GmbH + Co. KG | 4621.1 | |
| Sulfadiazine | Sigma-Aldrich | S6387 | |
| Tetracycline | AppliChem GmbH | 2228.0025 | |
| T4 Ligase 5 U/µl | Thermo Fisher Scientific | EL0011 | |
| T4 Ligase 30 U/µl | Thermo Fisher Scientific | EL0013 |
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