Inductible, Expression spécifique au Type cellulaire chez Arabidopsis thaliana médiation par le biais de LhGR Trans-Activation
Summary
Ici, nous décrivons la génération et l’application d’un ensemble de transgéniques Arabidopsis thaliana lignes habilitante expression inductible, tissu-spécifique dans les trois méristèmes principaux, le méristème apical, le méristème apical racinaire et le cambium.
Abstract
Expression inductible, tissu-spécifique est un outil important et puissant pour étudier la dynamique spatio-temporelle des perturbations génétiques. Combinant la GreenGate souple et efficace avec l’éprouvée et Benchmarké LhGR système (ici appelé GR-LhG4) pour l’expression inductible de clonage, nous avons généré un ensemble de lignées transgéniques de Arabidopsis qui permet de piloter l’expression d’un effecteur cassette dans un éventail de types de cellules spécifiques dans les méristèmes usine principale trois. À cette fin, nous avons choisi le système GR-LhG4 déjà élaborée, fondé sur un facteur de transcription chimérique et un promoteur apparenté de type pOp , assurer un contrôle serré sur un large éventail de niveaux d’expression. En outre, afin de visualiser le domaine d’expression où le facteur de transcription synthétique est actif, un journaliste fluorescent mTurquoise2 ER localisée sous le contrôle du promoteur pOp4 ou pOp6 est codé en lignes correspondant au pilote. Ici, nous décrivons les étapes nécessaires pour générer une ligne pilote ou effectrices et démontrer comment expression spécifiques du type cellulaire peut être induite et suivie dans le méristème apical, le méristème apical racinaire et le cambium d’Arabidopsis. En utilisant le pilote plusieurs ou toutes les lignes, l’effet de contexte spécifique d’exprimer un ou plusieurs facteurs (effecteurs) sous contrôle du promoteur synthétique pOp peut être évaluées rapidement, par exemple chez les plantes F1 d’un croisement entre un effecteur et multiple lignes de pilote. Cette approche est illustrée par l’expression ectopique de VND7, un facteur de transcription du CNA capable d’induire la déposition ectopique cellule secondaire de la paroi de manière autonome de la cellule.
Introduction
Une limitation majeure en biologie dans l’ère postgénomique est à déchiffrer le rôle spécifique du contexte d’un facteur donné ou perturbation génétique. Constitutives perturbations génétiques comme les approches de perte de fonction et de gain de fonction permettent souvent seulement point final une analyse des processus d’adaptation permanente, dissimuler la distinction entre les effets primaires et secondaires. En outre, des fonctions spécifiques de contexte peuvent être masquées ou diluées par des effets à grande échelle en tissus éloignés ou pendant d’autres phases de développement. En outre, dans les cas extrêmes, la létalité peut empêcher toute idée mécanistique. Idéalement, pour contourner ces problèmes, on pourrait analyser l’effet d’une perturbation génétique aiguë dans un contexte spécifique tel qu’un type de cellule spécifique d’une manière résolue dans le temps. Pour ce faire, des outils génétiques pour inductible, expression spécifique au type de cellule sont requis1. Pour fournir une ressource pour l’évaluation rapide de la dynamique spatio-temporelle d’une réponse à un effecteur donné, nous avons combiné la facilité du clonage fournies par le système de GreenGate2 avec l’efficacité prouvée du système GR-LhG43, 4,5,6. Nous avons généré un ensemble de lignes exprimant le facteur de transcription chimérique LhG4 fondu pour le domaine de liaison du ligand du récepteur (GR) corticoïdes rat7 sous le contrôle du type de cellule bien caractérisés promoteurs spécifiques8. En conditions de repos, le facteur de transcription reste en dehors du noyau, comme le domaine des ressources génétiques est lié par la HSP90 cytosolique. Avec l’ajout de ligands synthétiques dexaméthasone, translocation nucléaire est induite et LhG4 vont médier transcription des cassettes d’expression sous contrôle d’un promoteur analogues synthétiques de type pOp , comme un journaliste mTurquoise2 inclus dans les lignes correspondant au pilote de visualiser le domaine d’expression après l’induction. Ainsi, les lignes correspondant au pilote techniquement aussi contenant une cassette d’effecteur. La traversée d’un ensemble de lignes correspondant au pilote avec une ligne transportant une cassette d’effecteur avec, par exemple, un gène d’intérêt sous le contrôle du même promoteur pOp-type donc permet une évaluation rapide des conséquences aiguës ou à long terme d’expression de l’effecteur dans un large éventail de types de cellules.
Ici, nous fournissons un protocole décrivant les procédures nécessaires pour générer les lignes pilote et effectrices et démontrer comment expression spécifiques du type cellulaire peut être induite et suivie dans le méristème apical, le méristème apical racinaire et le cambium de Arabidopsis. Pour illustrer la prouesse et la spécificité de cette approche, nous utilisons le facteur de transcription bien connu VND7 qui est capable de piloter des épaississements de mur de cellules du xylème secondaire façon ectopique9. Traitement de F1 d’un croisement entre la ligne de pilote pSCR10,11 et l’effecteur pOp6:VND7 conduit à la formation des cellules du xylème ectopiques dans la gaine de l’amidon de l’ Arabidopsis , les cellules souches.
Pour faciliter la génération de grands assemblages d’ADN requis pour construire des plasmides d’expression conducteur et effectrices, nous avons utilisé le GreenGate rapide et efficace méthode2le clonage. GreenGate clonage est basé sur les enzymes de restriction type II S tels Eco31I ou ses isochizomère BsaI2. Ces enzymes couper en aval de leurs sites de reconnaissance asymétrique produisant des surplombs avec des variables de composition en bases. En intégrant l’ éco31I /Bsaj’ai des sites de restriction en oligonucléotides et affectation des séquences spécifiques de porte-à-faux à des éléments d’ADN, clonage modulaire est atteint, facilitant la génération de grandes assemblées. Dans le cadre de GreenGate, modules d’ADN relèvent de catégories Qu’a à F repose sur la séquence de surplomb qui servent de cartes et sont montés dans cet ordre. Les amorces conçues pour amplifier votre produit désiré devraient donc selon le module sélectionné2 (Figure 1 a). Si il y a un interne Eco31I /Bsaje site et la séquence n’est pas compatible avec les modules d’entrée et de la destination de GreenGate, vous pouvez procéder sans la mutagenèse, mais avec une efficacité moindre. Également utiliser mutagenèse pour supprimer Eco31I /Bsaj’ai des sites de restriction prenant soin de ne pas pour changer d’acides aminés dans les produits des gènes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici, nous décrivons les étapes nécessaires pour générer et appliquer un outil polyvalent et complet pour inductible, cellule type spécifique trans-activation. Traversée de lignées porteuses de cassettes d’effecteur sous contrôle du promoteur pOp avec des lignes de pilote permet étudie les effets de l’expression erronée dans la génération F1, ce qui permet une évaluation rapide de perturbation génétique dans un large éventail de types de cellules. Alternativement, effecteur des const…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Travail dans nos laboratoires est pris en charge par le fondation de recherche allemande (DFG) subventions WO 1660/6-1 (S.W.) et GR 2104/4-1 (à T.G.) et SFB1101 (à T.G. et J.U.L) et par un Conseil de recherche européen consolidator grant (PLANTSTEMS 647148) à T.G. S.W. est pris en charge par le biais de l’Emmy Noether Fellowship de la DFG par Grant WO 1660/2.
Materials
| Ampicillin | Carl Roth GmbH + Co. KG | K029.1 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C1919 | |
| Column purification | Qiagen | QIAquick PCR Purification Kit (250) | |
| Culture chamber for imaging | Sarstedt AG & Co. KG | 1-well tissue culture chamber, on cover glass II | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4903 | |
| DMSO | Fisher Scientific, UK | D139-1 | |
| Eco31I | Thermo Fisher Scientific | FD0294 | |
| injection cannula (0.30 x 12 mm, 30 G x 1/2) | Sterican, Braun | ||
| Kanamycin | Carl Roth GmbH + Co. KG | T832.2 | |
| Leica TCS SP5 CLSM, HCX PL APO lambda blue 63x water immersion objectiv | Leica, Wetzlar, Germany | ||
| MS medium | Duchefa, Haarlem, Netherlands | M0221.0050 | |
| Nikon A1 CLSM, Apo LWD 25x 1.1 NA water immersion objective | Nikon, Minato, Tokyo, Japan | ||
| Petri dish 35/10 mm | Greiner Bio-One GmbH, Germany | 627102 | |
| Petri dish 60/150 mm | Greiner Bio-One GmbH, Germany | 628102 | |
| Petri dish 120/120/17 | Greiner Bio-One GmbH, Germany | 688102 | |
| Plant agar | Duchefa, Haarlem, Netherlands | P1001 | |
| Plasmid extraction | Qiagen | QIAprep Spin Miniprep Kit | |
| Propidium iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | |
| Razorblade | Classic, Wilkinson Sword GmbH | 7005115E | |
| Reaction tubes | Sarstedt AG & Co. KG | 72.690.001 | |
| Silwet L-77 | Kurt Obermeier GmbH & Co. KG, Bad Berleburg, Germany | ||
| Spectinomycin | AppliChem GmbH | 3834.001 | |
| Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | NanoDrop 2000c | |
| Sucrose | Carl Roth GmbH + Co. KG | 4621.1 | |
| Sulfadiazine | Sigma-Aldrich | S6387 | |
| Tetracycline | AppliChem GmbH | 2228.0025 | |
| T4 Ligase 5 U/µl | Thermo Fisher Scientific | EL0011 | |
| T4 Ligase 30 U/µl | Thermo Fisher Scientific | EL0013 |
References
- Moore, I., Samalova, M., Kurup, S. Transactivated and chemically inducible gene expression in plants. The Plant Journal. 45 (4), 651-683 (2006).
- Lampropoulos, A., et al. GreenGate—a novel, versatile, and efficient cloning system for plant transgenesis. PLoS One. 8 (12), e83043 (2013).
- Baroux, C., et al. Predictable activation of tissue-specific expression from a single gene locus using the pOp/LhG4 transactivation system in Arabidopsis. Plant Biotechnology Journal. 3 (1), 91-101 (2005).
- Craft, J., et al. New pOp/LhG4 vectors for stringent glucocorticoid-dependent transgene expression in Arabidopsis. The Plant Journal. 41 (6), 899-918 (2005).
- Moore, I., Galweiler, L., Grosskopf, D., Schell, J., Palme, K. A transcription activation system for regulated gene expression in transgenic plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (1), 376-381 (1998).
- Samalova, M., Brzobohaty, B., Moore, I. pOp6/LhGR: a stringently regulated and highly responsive dexamethasone-inducible gene expression system for tobacco. The Plant Journal. 41 (6), 919-935 (2005).
- Picard, D. Steroid-binding domains for regulating the functions of heterologous proteins in cis. Trends in Cell Biology. 3 (8), 278-280 (1993).
- Schurholz, A. K., et al. A Comprehensive Toolkit for Inducible, Cell Type-Specific Gene Expression in Arabidopsis. Plant Physiology. 178 (1), 40-53 (2018).
- Kubo, M., et al. Transcription switches for protoxylem and metaxylem vessel formation. Genes and Development. 19 (16), 1855-1860 (2005).
- Di Laurenzio, L., et al. The SCARECROW gene regulates an asymmetric cell division that is essential for generating the radial organization of the Arabidopsis root. Cell. 86 (3), 423-433 (1996).
- Wysocka-Diller, J. W., Helariutta, Y., Fukaki, H., Malamy, J. E., Benfey, P. N. Molecular analysis of SCARECROW function reveals a radial patterning mechanism common to root and shoot. Development. 127 (3), 595-603 (2000).
- Hellens, R. P., Edwards, E. A., Leyland, N. R., Bean, S., Mullineaux, P. M. pGreen: a versatile and flexible binary Ti vector for Agrobacterium-mediated plant transformation. Plant Molecular Biology. 42 (6), 819-832 (2000).
- Zhang, X., Henriques, R., Lin, S. S., Niu, Q. W., Chua, N. H. Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method. Nature Protocols. 1 (2), 641-646 (2006).
- Kleinboelting, N., Huep, G., Kloetgen, A., Viehoever, P., Weisshaar, B. GABI-Kat SimpleSearch: new features of the Arabidopsis thaliana T-DNA mutant database. Nucleic Acids Research. 40 (Database issue), D1211-D1215 (2012).
- . Selection scheme used at GABI-Kat for resistance to sulfadiazine Available from: https://www.gabi-kat.de/methods/sul-selection-scheme.html (2018)
- Huang, Y., et al. Standard addition quantitative real-time PCR (SAQPCR): a novel approach for determination of transgene copy number avoiding PCR efficiency estimation. PLoS One. 8 (1), e53489 (2013).
- Wallner, E. S., et al. Strigolactone- and Karrikin-Independent SMXL Proteins Are Central Regulators of Phloem Formation. Current Biology. 27 (8), 1241-1247 (2017).
- Fletcher, J. C., Brand, U., Running, M. P., Simon, R., Meyerowitz, E. M. Signaling of cell fate decisions by CLAVATA3 in Arabidopsis shoot meristems. Science. 283 (5409), 1911-1914 (1999).
- Watanabe, Y., et al. Visualization of cellulose synthases in Arabidopsis secondary cell walls. Science. 350 (6257), 198-203 (2015).
- Yamaguchi, M., et al. VASCULAR-RELATED NAC-DOMAIN6 and VASCULAR-RELATED NAC-DOMAIN7 effectively induce transdifferentiation into xylem vessel elements under control of an induction system. Plant Physiology. 153 (3), 906-914 (2010).
- Engineer, C. B., Fitzsimmons, K. C., Schmuke, J. J., Dotson, S. B., Kranz, R. G. Development and evaluation of a Gal4-mediated LUC/GFP/GUS enhancer trap system in Arabidopsis. BMC Plant Biology. 5, 9 (2005).
- Aoyama, T., Chua, N. H. A glucocorticoid-mediated transcriptional induction system in transgenic plants. The Plant Journal. 11 (3), 605-612 (1997).
- Decaestecker, W., et al. CRISPR-TSKO facilitates efficient cell type-, tissue-, or organ-specific mutagenesis in Arabidopsis. bioRxiv. , (2018).
