Inducible, תאים ייחודיים לסוג ביטוי תודרנית לבנה בתיווך דרך LhGR טרנס-הפעלה
Summary
כאן, אנו מתארים את הדור, יישום של קבוצת הטרנסגניים תודרנית לבנה קווי המאפשרת ביטוי inducible, רקמות ספציפיות את meristems הראשי שלוש, את meristem apical לירות, meristem apical את שורש ו את cambium.
Abstract
הביטוי inducible, רקמות ספציפיות הוא כלי חשוב ורב עוצמה כדי ללמוד את הדינמיקה-עתיים של ההפרעות גנטיות. שילוב של GreenGate גמיש ויעיל שכפול מערכת במערכת מוכחות, benchmarked LhGR (הנקרא כאן GR-LhG4) עבור הביטוי inducible, יש לנו שנוצר הטרנסגניים קווים תודרנית שיכולים להביא את הביטוי אפקטור קלטות במגוון של סוגי תאים מסוים ב- meristems שלוש המפעל הראשי. למטרה זו, בחרנו את המערכת GR-LhG4 בעבר מפותח בהתבסס על פקטור שעתוק chimeric מקדם cognate פופ-סוג להבטיח שליטה הדוקה על מגוון רחב של רמות הביטוי. בנוסף, כדי להמחיש את התחום ביטוי איפה הפעיל הפקטור שעתוק סינתטי, כתב פלורסנט מותאמת לשפות אחרות ER mTurquoise2 תחת שליטה של האמרגן pOp4 או pOp6 מקודד בקווים הנהג. כאן, אנו מתארים את השלבים הנחוצים ליצור קו הנהג או אפקטור ומדגימים איך ביטוי ספציפי של סוג התא יכול להיות המושרה ועקבתי meristem apical את הצילומים, meristem apical את השורש, את cambium של תודרנית. באמצעות מספר או כל מנהל קווים, ההשפעה הספציפית בהקשר לביטוי אחד או גורמים רבים (effectors) תחת שליטה של האמרגן סינתטי פופ יכול להיות מוערך במהירות, לדוגמה בצמחים F1 של הכלאה בין אפקטור אחד מרובה מנהל ההתקן של קווים. גישה זו היא דוגמה לביטוי חוץ רחמי של VND7, גורם שעתוק NAC מסוגל גרימת התצהיר קיר חוץ רחמי משני תאים באופן אוטונומיים תא.
Introduction
מגבלה משמעותית בביולוגיה בעידן postgenomic הוא לפענח את התפקיד בהקשר ספציפי של גורם מסוים או ההפרעות גנטיות. מכוננת לפליטת גנטיות כגון אובדן-של-פונקציה ופונקציה רווח-של גישות אפשר לעתים קרובות רק מובילים ניתוח של תהליכי הסתגלות חיים ארוך, טשטוש ההבחנה בין אפקטים ראשיים ומשניים. בנוסף, פונקציות ספציפיות בהקשר יכול להיות רעולי פנים או מדולל על ידי תופעות בקנה מידה גדול ברקמות מרוחק או במהלך בשלבים אחרים של פיתוח. יתר על כן, במקרים קיצוניים, lethality יכול למנוע כל תובנה מכניסטית. באופן אידיאלי, כדי לעקוף בעיות אלה, אחד יכול לנתח את השפעת ההפרעות גנטיות חריפה בתוך הקשר מסוים כגון סוג תא מסוים באופן זמן לפתור. כדי להשיג זאת, כלים גנטיים לביטוי ייחודיים לסוג התא inducible, הם נדרשים1. כדי לספק משאב להערכה מהירה של תגובה אפקטור נתון הדינמיקות ייתכן, שילבנו להקל על שיבוט שמספק את מערכת GreenGate2 עם יעילות מוכחת של מערכת GR-LhG43, 45,,6. יש לנו שנוצר קווים לבטא את הפקטור שעתוק chimeric ש-lhg4 התמזגו איגוד ליגנד לתחום של עכברוש corticoid קולטן (גר)7 תחת השליטה של התא מאופיין היטב סוג ספציפי היזמים8. ב נח תנאים, הגורם שעתוק נשאר מחוץ לגרעין, כמו התחום GR נמדד על ידי HSP90 cytosolic. עם התוספת של דקסאמתאזון ליגנד סינתטי (דקס), רוברטסונית גרעיני מושרה ולסיים LhG4 תמלול קלטות ביטוי תחת שליטה של מקדם cognate סינתטי מסוג pOp , כגון כתב mTurquoise2 כולל הקווים הנהג כדי להמחיש את התחום ביטוי לאחר אינדוקציה. לפיכך, הקווים הנהג טכנית מכילים גם של קלטת אפקטור. המעבר של הנהג קווים עם שורת נושא של קסטה אפקטור עם, למשל, גן עניין תחת שליטה של האמרגן מסוג pOp אותו ובכך מאפשר את ההערכה המהירה ההשלכות חריפה או לטווח ארוך של הביטוי אפקטור במגוון רחב של סוגי תאים.
כאן, אנו מספקים פרוטוקול המתאר את ההליכים הדרושים כדי ליצור את השורות הנהג ואפקטור ומדגימים איך ביטוי ספציפי של סוג התא יכול להיות המושרה ועקבתי meristem apical את הצילומים, meristem apical את השורש, את cambium של תודרנית. כדי להמחיש את המיומנות וספציפיות של גישה זו, אנו מנצלים את הגורם תמלול ידועה VND7 המסוגל נהיגה thickenings קיר דמוי עצה משנית תא ectopically9. בטיפול F1 מן הכלאה בין את pSCR10,11 הנהג ובין pOp6:VND7 אפקטור הקו שמוביל היווצרות של תאים כמו עצה חוץ רחמי נדן עמילן בתאים של תודרנית גזע.
כדי להקל על הדור של מכלולים דנ א גדולים הנדרשים לבניית פלסמידים ביטוי אפקטור ונהג, השתמשנו GreenGate מהירה ויעילה שיבוט שיטה2. שיבוט של GreenGate בהתבסס על סוג II S אנזימי הגבלה כגון לסביבה31I או isoschizomer שלו, Bsaאני2. אנזימים אלה לחתוך במורד הזרם של אתרי זיהוי אסימטרי שלהם בהפקת המסוכך עם משתנה הרכב הבסיס. על ידי שילוב לסביבה31I /Bsaאני הגבלת אתרי oligonucleotides, הקצאת רצפי הסככה ספציפי לרכיבי ה-DNA, שיבוט מודולרי מושגת, להקל על הדור של מכלולים גדולים. במסגרת GreenGate, מודולי ה-DNA נחלקים קטגוריות ש-a-F המבוססת על רצף הסככה לשמש מתאמי, הם התאספו לפי הסדר הזה. לכן, צבעי יסוד שנועד להגביר את המוצר הרצוי צריך להיות בהתאם המודול שנבחר2 (איור 1 א’). אם יש פנימיים לסביבה31I /Bsaאני באתר ואת הרצף אינה תואמת מודולי כניסה והיעד של GreenGate, תמשיך ללא mutagenizing, אבל עם יעילות נמוכה יותר. לחלופין, השתמש מוטגנזה להסרת לסביבה31I /Bsaאני אתרי הגבלת מטפל לא לשינוי חומצות אמינו במוצרים ג’ין.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן, אנו מתארים את השלבים הנחוצים ליצור ולהחיל ערכת כלים מגוונים ומקיפים inducible, תא סוג ספציפי הטרנס-הפעלה. חציית קווים נושאת אפקטור קלטות תחת שליטה של האמרגן פופ עם הנהג קווים מאפשר ללמוד את ההשפעות ביטוי שגויה בדור F1, המאפשר להערכת ההפרעות גנטיות במגוון רחב של סוגי תאים מהירה. לח?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה במעבדות שלנו נתמך על ידי קרן מחקר גרמני (DFG) מענקים WO 1660/6-1 (לונדון), GR 2104/4-1 (ל. ת. ג), SFB1101 (לת. ג ו- J.U.L), על ידי המועצה האירופית מחקר הממזגת נכסי הענק (PLANTSTEMS 647148) לת. ג ייגמר בתיקו נתמכת באמצעות אמי נתר אחוות DFG דרך גרנט WO 1660/2.
Materials
| Ampicillin | Carl Roth GmbH + Co. KG | K029.1 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C1919 | |
| Column purification | Qiagen | QIAquick PCR Purification Kit (250) | |
| Culture chamber for imaging | Sarstedt AG & Co. KG | 1-well tissue culture chamber, on cover glass II | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4903 | |
| DMSO | Fisher Scientific, UK | D139-1 | |
| Eco31I | Thermo Fisher Scientific | FD0294 | |
| injection cannula (0.30 x 12 mm, 30 G x 1/2) | Sterican, Braun | ||
| Kanamycin | Carl Roth GmbH + Co. KG | T832.2 | |
| Leica TCS SP5 CLSM, HCX PL APO lambda blue 63x water immersion objectiv | Leica, Wetzlar, Germany | ||
| MS medium | Duchefa, Haarlem, Netherlands | M0221.0050 | |
| Nikon A1 CLSM, Apo LWD 25x 1.1 NA water immersion objective | Nikon, Minato, Tokyo, Japan | ||
| Petri dish 35/10 mm | Greiner Bio-One GmbH, Germany | 627102 | |
| Petri dish 60/150 mm | Greiner Bio-One GmbH, Germany | 628102 | |
| Petri dish 120/120/17 | Greiner Bio-One GmbH, Germany | 688102 | |
| Plant agar | Duchefa, Haarlem, Netherlands | P1001 | |
| Plasmid extraction | Qiagen | QIAprep Spin Miniprep Kit | |
| Propidium iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | |
| Razorblade | Classic, Wilkinson Sword GmbH | 7005115E | |
| Reaction tubes | Sarstedt AG & Co. KG | 72.690.001 | |
| Silwet L-77 | Kurt Obermeier GmbH & Co. KG, Bad Berleburg, Germany | ||
| Spectinomycin | AppliChem GmbH | 3834.001 | |
| Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | NanoDrop 2000c | |
| Sucrose | Carl Roth GmbH + Co. KG | 4621.1 | |
| Sulfadiazine | Sigma-Aldrich | S6387 | |
| Tetracycline | AppliChem GmbH | 2228.0025 | |
| T4 Ligase 5 U/µl | Thermo Fisher Scientific | EL0011 | |
| T4 Ligase 30 U/µl | Thermo Fisher Scientific | EL0013 |
References
- Moore, I., Samalova, M., Kurup, S. Transactivated and chemically inducible gene expression in plants. The Plant Journal. 45 (4), 651-683 (2006).
- Lampropoulos, A., et al. GreenGate—a novel, versatile, and efficient cloning system for plant transgenesis. PLoS One. 8 (12), e83043 (2013).
- Baroux, C., et al. Predictable activation of tissue-specific expression from a single gene locus using the pOp/LhG4 transactivation system in Arabidopsis. Plant Biotechnology Journal. 3 (1), 91-101 (2005).
- Craft, J., et al. New pOp/LhG4 vectors for stringent glucocorticoid-dependent transgene expression in Arabidopsis. The Plant Journal. 41 (6), 899-918 (2005).
- Moore, I., Galweiler, L., Grosskopf, D., Schell, J., Palme, K. A transcription activation system for regulated gene expression in transgenic plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (1), 376-381 (1998).
- Samalova, M., Brzobohaty, B., Moore, I. pOp6/LhGR: a stringently regulated and highly responsive dexamethasone-inducible gene expression system for tobacco. The Plant Journal. 41 (6), 919-935 (2005).
- Picard, D. Steroid-binding domains for regulating the functions of heterologous proteins in cis. Trends in Cell Biology. 3 (8), 278-280 (1993).
- Schurholz, A. K., et al. A Comprehensive Toolkit for Inducible, Cell Type-Specific Gene Expression in Arabidopsis. Plant Physiology. 178 (1), 40-53 (2018).
- Kubo, M., et al. Transcription switches for protoxylem and metaxylem vessel formation. Genes and Development. 19 (16), 1855-1860 (2005).
- Di Laurenzio, L., et al. The SCARECROW gene regulates an asymmetric cell division that is essential for generating the radial organization of the Arabidopsis root. Cell. 86 (3), 423-433 (1996).
- Wysocka-Diller, J. W., Helariutta, Y., Fukaki, H., Malamy, J. E., Benfey, P. N. Molecular analysis of SCARECROW function reveals a radial patterning mechanism common to root and shoot. Development. 127 (3), 595-603 (2000).
- Hellens, R. P., Edwards, E. A., Leyland, N. R., Bean, S., Mullineaux, P. M. pGreen: a versatile and flexible binary Ti vector for Agrobacterium-mediated plant transformation. Plant Molecular Biology. 42 (6), 819-832 (2000).
- Zhang, X., Henriques, R., Lin, S. S., Niu, Q. W., Chua, N. H. Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method. Nature Protocols. 1 (2), 641-646 (2006).
- Kleinboelting, N., Huep, G., Kloetgen, A., Viehoever, P., Weisshaar, B. GABI-Kat SimpleSearch: new features of the Arabidopsis thaliana T-DNA mutant database. Nucleic Acids Research. 40 (Database issue), D1211-D1215 (2012).
- . Selection scheme used at GABI-Kat for resistance to sulfadiazine Available from: https://www.gabi-kat.de/methods/sul-selection-scheme.html (2018)
- Huang, Y., et al. Standard addition quantitative real-time PCR (SAQPCR): a novel approach for determination of transgene copy number avoiding PCR efficiency estimation. PLoS One. 8 (1), e53489 (2013).
- Wallner, E. S., et al. Strigolactone- and Karrikin-Independent SMXL Proteins Are Central Regulators of Phloem Formation. Current Biology. 27 (8), 1241-1247 (2017).
- Fletcher, J. C., Brand, U., Running, M. P., Simon, R., Meyerowitz, E. M. Signaling of cell fate decisions by CLAVATA3 in Arabidopsis shoot meristems. Science. 283 (5409), 1911-1914 (1999).
- Watanabe, Y., et al. Visualization of cellulose synthases in Arabidopsis secondary cell walls. Science. 350 (6257), 198-203 (2015).
- Yamaguchi, M., et al. VASCULAR-RELATED NAC-DOMAIN6 and VASCULAR-RELATED NAC-DOMAIN7 effectively induce transdifferentiation into xylem vessel elements under control of an induction system. Plant Physiology. 153 (3), 906-914 (2010).
- Engineer, C. B., Fitzsimmons, K. C., Schmuke, J. J., Dotson, S. B., Kranz, R. G. Development and evaluation of a Gal4-mediated LUC/GFP/GUS enhancer trap system in Arabidopsis. BMC Plant Biology. 5, 9 (2005).
- Aoyama, T., Chua, N. H. A glucocorticoid-mediated transcriptional induction system in transgenic plants. The Plant Journal. 11 (3), 605-612 (1997).
- Decaestecker, W., et al. CRISPR-TSKO facilitates efficient cell type-, tissue-, or organ-specific mutagenesis in Arabidopsis. bioRxiv. , (2018).
