زرع الكلي الفئران العظام: نهج الجراحية الجديدة والمبسطة
Summary
الغرض من هذه المخطوطة والبروتوكول هو شرح وتوضيح بالتفصيل الاجراء الجراحي لزرع الكلي التقويمي في الفئران. يتم تبسيط هذه الطريقة لتحقيق التروية الصحيحة من الكلي المتبرع وتقصير الوقت ضخ باستخدام تقنيه انسموسيس الوريدي والكفة حالب.
Abstract
زراعه الكلي يقدم زيادة معدلات البقاء علي قيد الحياة وتحسين نوعيه المعيشة للمرضي الذين يعانون من مرض كلوي في نهاية المرحلة ، بالمقارنة مع اي نوع من العلاج باستبدال الكلي. علي مدي العقود القليلة الماضية ، تم استخدام نموذج زراعه الكلي الفئران لدراسة الظواهر المناعية للرفض والتسامح. وقد أصبح هذا النموذج أداه لا غني عنها لاختبار الادويه المناعية الجديدة والنظم العلاجية قبل المضي قدما في دراسات الحيوانية الكبيرة الباهظة الثمن.
يوفر هذا البروتوكول نظره عامه مفصله حول كيفيه اجراء عمليه زرع الكلي التقويمية بشكل موثوق في الفئران. يتضمن هذا البروتوكول ثلاث خطوات مميزه تزيد من احتماليه النجاح: التروية الكلوية المتبرع بها عن طريق المسح من خلال الوريد المدخل واستخدام نظام الكفة لانسز الاورده الكلوية والحالب ، التالي تقليل البرد والدفء مرات نقص التروية. باستخدام هذه التقنية ، حققنا معدلات البقاء علي قيد الحياة بعد 6 أشهر مع الكرياتينين المصل العادي في الماشية مع عمليات زرع الكلي أو متسامحة. اعتمادا علي الهدف من الدراسة ، يمكن تعديل هذا النموذج عن طريق العلاجات قبل أو بعد الزرع لدراسة الرفض الحاد ، المزمن ، الخلوي ، أو بوساطة الأجسام المضادة. وهو نموذج حيواني قابل للتكرار وموثوق به وفعال من حيث التكلفة لدراسة الجوانب المختلفة لزراعه الكلي.
Introduction
تاريخيا ، تم اجراء أول دراسات رفض الزراعة من قبل برنت ومدور باستخدام زرع الجلد في القوارض1. سرعان ما أصبح من الواضح ان الجلد له ميزات مناعية متميزة ، مما يجعل من جهاز مناعي للغاية التي تختلف في الرفض من غيرها من الاجهزه الصلبة الاوعيه الدموية2. وعاده ما تقتصر دراسات الفئران لرفض زرع الأعضاء الصلبة علي زرع القلب والكبد والكلي. علي الرغم من ان كل من هذه الاجهزه هي مناسبه لدراسة الرفض ، وهناك مزايا وعيوب لكل منهم. وغالبا ما يتم زرع زرع القلب في البطن والانسام إلى الشريان الابهر والوريد الأجوف ، مع القلب الأصلي للمستلم في المكان3. وهذا لا يعيد الظروف السريرية والتشريحية والفسيولوجية البشرية. بالاضافه إلى ذلك ، قلوب حساسة جدا لنقص التروية الباردة ويجب ان يكون reperfusedها بشكل تفضيلي داخل 1 ح من أجل ان تكون قادره علي استعاده وظيفتها4. تعتبر عمليات زرع الكبد بشكل عام أكثر صعوبة وحساسية من الوقت لأداء الجراحة. بعد أزاله الكبد الام, الكبد المتبرع يجب ان تكون مزروعة وأعاده استخدامها في غضون 30 دقيقه كما المتلقيين لا يمكن ان تستمر لفتره أطول دون الكبد يعمل5. الشريان الكبدي ، الوريد البابي ، وخاصه أعاده بناء القناة الصفراوية يتطلب المهارات الجراحية المكررة. إلى جانب التحديات الجراحية ، ومن المعروف ان الكبد تمتلك خصائص التحمل والقوارض والبشر يمكن ان تصبح متسامحة من الناحية التشغيلية6،7،8. الكلي ، علي عكس الأعضاء المذكورة أنفا ، يمكن زرعها في الأزياء التقويمية ، ومن المعروف ان يكون الجهاز المناعي مع حلقات الرفض متسقة وقابله للتكرار (ان لم يكن المناعي) ، ويسمح لفترات طويلة الباردة نقص التروية مرات من عده ساعات. وهذا يجعل زراعه الكلي الفئران نموذجا مثاليا لدراسة رفض الطعم المخلوط والتسامح.
زراعه الكلي (KT) هو الخيار المفضل لعلاج المرضي الذين يعانون من مرض كلوي في نهاية المرحلة. علي مدي العقود القليلة الماضية ، تحسنت نتائج البقاء علي المدى القصير بعد KT بشكل كبير ، ولكن نتائج البقاء علي المدى الطويل راكدة9. الانظمه التقليدية المثبطة للمناعة تبقي العلاج القياسي المضاد للرفض. ومع ذلك ، فان الاستخدام المزمن للعلاجات المثبطة للمناعة يسبب اعتلالات ووفاات كبيره ، مثل السمية الكلوية ، ومرض السكري ، والأورام الخبيثة الثانوية10،11،12. وعلي المدى الطويل ، يهدد الرفض المزمن للأجسام المضادة والخلايا الخلوية بقاء الكسب غير المرتبط بالطعم ، مع توافر خيارات علاجيه محدوده.
ويتمثل أحد الأهداف الرئيسية لعمليه الزرع في الحث علي تحمل الزراعة من أجل تفادي الحاجة إلى كبت المناعة المزمن. نموذج KT الفئران هو أداه قويه للتحقيق في عمليه الرفض المناعي وتقييم النهج الجديدة للمناعة والتسامح زرع. الجرذ أيضا بمثابه نموذج مناسب لدراسة الخلايا الحاده والمزمنة والرفض بوساطة الأجسام المضادة13،14،15،16،17. وقد اثبت هذا النموذج الجراحي انه أداه موثوقه وقابله للتكرار وفعاله من حيث التكلفة لدراسة مختلف جوانب رفض الكسب غير المزروع والتسامح. وغالبا ما يستخدم لاختبار البروتوكولات الجديدة التي تحفز التسامح قبل القيام بدراسات الحيوانية الكبيرة المكلفة والمرهقة. تنفيذ KT في الفئران يتطلب التدريب الجراحي واسعه النطاق والخبرة للوصول إلى معدلات البقاء علي قيد الحياة من > 90 ٪. في هذه المخطوطة وفي الفيديو التعليمي المصاحب لها ، نقدم لك مخططا تفصيليا لخطوه بخطوه في الفئران ، كما تم تنفيذه بنجاح لسنوات عديده في مؤسستنا.
قبل البدء في اي اجراء ، اختيار المانحين والمتلقيين أمر بالغ الاهميه ويعتمد علي طبيعة التجربة. ومن الناحية المثالية ، ينبغي ان تزن الجهات المانحة والمتلقية ما بين 220 – 260 غ وان تتراوح أعمارهم بين 8 و 12 أسبوعا. الحيوانية تحت 220 g لديها الشرايين الصغيرة القطر ، والاورده ، والحالب ، مما يجعل الانسمام في المتلقي تحديا بشكل خاص. فقدان الدم البسيط يمكن ان يسبب نقص الكالسيوم ويؤدي إلى الموت في الكائنات الصغيرة. الحيوانية أثقل من 260 g عرض المزيد من الدهون حول السفن الخاصة بهم ، وعزل السفينة سوف تتطلب المزيد من الوقت المنطوق وزيادة الوقت الاسكيميه الباردة.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه المخطوطة ، نقوم بوصف الطريقة الجراحية للمفصل الهجائي في الجرذان بالتفصيل ، بما في ذلك جميع المعدات اللازمة لتنفيذ هذا الاجراء (الشكل 5). في 1965, نشر [فيشر] و ماوي التقرير اولي علي [كت] في فيران, اي أصبح البداية من مثيره تحقيق مجال18. ومنذ ذلك الحين ، أدخلت تعدي…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا العمل من قبل هديه سخية من الحوزة الاسره Bombeck.
Materials
| Buprenorphine HCL | Reckitt Benckiser Healthcare UK | NDC12496-0757-5 | |
| Dissecting forceps, curved | Zhenbang, China | 11cm Flat handle | |
| Heparin sodium injection USP | Sagent Pharmaceuticals | NDC25021-400-10 | |
| Micro-forceps, straight, smooth | Jingzhong, China | WA3010 | |
| Micro needle holder | Jingzhong, China | WA2010 | |
| Micro vessel clamps | Jingzhong, China | WA40120 | |
| Micro spring sciccor 1 | ROBOZ | RS-5620 | |
| Micro spring sciccor 2 | F.S.T. | 91501-09 | |
| Micro spring sciccor 3 | Zhenbang, China | 8.5cm Vannas,curved | |
| Prograf (Tacrolimus/FK506) | Astellas | ||
| Rats | Charles River & Taconic Biosciences | LEW/Crl & DA-M | |
| Shaver | Wahl | 79600-2101 | |
| Suture 4-0 | Ethicon | J304H | |
| Suture, 4-0 | Ethicon | 683G | |
| Suture, 10-0 | Ethicon | 2820G | |
| Syringes & Needles | BD | ||
| Thread, 8-0 | Ashaway | 75290 | |
| Ureteral cuff | Microlumen | 160-1 | Polymide Tubing, Diameter 0.41 mm |
| Venous cuff | Intramedic BD | 7441 | PE-200 Non-radiopaque polyethylene tubing ID: 1.4 mm, OD: 1.9 mm |
References
- Billingham, R. E., Brent, L., Medawar, P. B. Actively acquired tolerance of foreign cells. Nature. 172 (4379), 603-606 (1953).
- Murray, J. E. Organ transplantation (skin, kidney, heart) and the plastic surgeon. Plastic and Reconstructive Surgery. 47 (5), 425-431 (1971).
- Liu, F., Kang, S. M. Heterotopic heart transplantation in mice. Journal of Visualized Experiments. (6), e238 (2007).
- Ruzza, A., et al. Heterotopic heart transplantation in rats: improved anesthetic and surgical technique. Transplant Proceedings. 42 (9), 3828-3832 (2010).
- Oldani, G., Lacotte, S., Morel, P., Mentha, G., Toso, C. Orthotopic liver transplantation in rats. Journal of Visualized Experiments. (65), e4143 (2012).
- Lang, K. S., et al. Immunoprivileged status of the liver is controlled by Toll-like receptor 3 signaling. Journal of Clinical Investigation. 116 (9), 2456-2463 (2006).
- Sun, Z., et al. Recruitment of host progenitor cells in rat liver transplants. Hepatology. 49 (2), 587-597 (2009).
- Orlando, G., Soker, S., Wood, K. Operational tolerance after liver transplantation. Journal of Hepatolgy. 50 (6), 1247-1257 (2009).
- Lodhi, S. A., Lamb, K. E., Meier-Kriesche, H. U. Solid organ allograft survival improvement in the United States: the long-term does not mirror the dramatic short-term success. American Journal of Transplantation. 11 (6), 1226-1235 (2011).
- Engels, E. A., et al. Spectrum of cancer risk among US solid organ transplant recipients. Journal of the American Medical Association. 306 (17), 1891-1901 (2011).
- Kasiske, B. L., Snyder, J. J., Gilbertson, D., Matas, A. J. Diabetes mellitus after kidney transplantation in the United States. American Journal of Transplantation. 3 (2), 178-185 (2003).
- de Mattos, A. M., Olyaei, A. J., Bennett, W. M. Nephrotoxicity of immunosuppressive drugs: long-term consequences and challenges for the future. American Journal of Kidney Diseases. 35 (2), 333-346 (2000).
- Hu, X., et al. Chimeric Allografts Induced by Short-Term Treatment With Stem Cell-Mobilizing Agents Result in Long-Term Kidney Transplant Survival Without Immunosuppression: A Study in Rats. American Journal of Transplantation. 16 (7), 2055-2065 (2016).
- Shrestha, B., Haylor, J. Experimental rat models of chronic allograft nephropathy: a review. International Journal of Nephrology and Renovascular Disease. 7, 315-322 (2014).
- Fu, Y., et al. Successful transplantation of kidney allografts in sensitized rats after syngeneic hematopoietic stem cell transplantation and fludarabine. American Journal of Transplantation. 14 (10), 2375-2383 (2014).
- Grau, V., et al. Immune Complex-Type Deposits in the Fischer-344 to Lewis Rat Model of Renal Transplantation and a Subset of Human Transplant Glomerulopathy. Transplantation. 100 (5), 1004-1014 (2016).
- Vogelbacher, R., et al. Bortezomib and sirolimus inhibit the chronic active antibody-mediated rejection in experimental renal transplantation in the rat. Nephrology Dialysis Transplantation. 25 (11), 3764-3773 (2010).
- Fisher, B., Lee, S. Microvascular surgical techniques in research, with special reference to renal transplantation in the rat. Surgery. 58 (5), 904-914 (1965).
- Mahabir, R. N., Guttmann, R. D., Lindquist, R. R. Renal transplantation in the inbred rat. X. A model of “weak histoincompatibility” by major locus matching. Transplantation. 8 (4), 369-378 (1969).
- Wang, J. J., Hockenheimer, S., Bickerstaff, A. A., Hadley, G. A. Murine renal transplantation procedure. Journal of Visualized Experiments. (29), e1150 (2009).
- Bickerstaff, A. A., Wang, J. J., Pelletier, R. P., Orosz, C. G. Murine renal allografts: spontaneous acceptance is associated with regulated T cell-mediated immunity. Journal of Immunology. 167 (9), 4821-4827 (2001).
- Silber, S. J., Crudop, J. Kidney transplantation in inbred rats. American Journal of Surgery. 125 (5), 551-553 (1973).
- D’Silva, M., et al. Rat kidney transplantation update with special reference to vesical calculi. Microsurgery. 11 (2), 169-176 (1990).
- Yin, M., Booster, M. H., Bogaard, A. E. J. M., Kootstra, G. A simple technique to harvest two kidneys from one donor rat for transplantation. Lab Animal. 28 (4), 387-390 (1994).
- Lopez-Neblina, F., Toledo-Pereyra, L. H., Suzuki, S. Ultrarapid orthotopic technique for renal transplantation in the rat. Microsurgery. 15 (4), 274-278 (1994).
- Blom, D., Orloff, M. S. A more versatile and reliable method for renal transplantation in the rat. Microsurgery. 18 (4), 267-269 (1998).
- Engelbrecht, G., Kahn, D., Duminy, F., Hickman, R. New rapid technique for renal transplantation in the rat. Microsurgery. 13 (6), 340-344 (1992).
- Kline, R., Churchill, M., Churchill, P., Bidani, A., Schwartz, M. High osmolality-low pH flush solutions improve renal transplant function in rats. Urology Research. 19 (2), 81-86 (1991).
- Fray, J. C. Mechanism by which renin secretion from perfused rat kidneys is stimulated by isoprenaline and inhibited by high perfusion pressure. The Journal of Physiology. 308, 1-13 (1980).
- Fry, D. L. Acute vascular endothelial changes associated with increased blood velocity gradients. Circulation Research. 22 (2), 165-197 (1968).
- Pahlavan, P. S., Smallegange, C., Adams, M. A., Schumacher, M. Kidney transplantation procedures in rats: assessments, complications, and management. Microsurgery. 26 (5), 404-411 (2006).
- Savas, C. P., et al. Renal transplantation in the rat–a new simple, non-suture technique. Urology Research. 13 (2), 91-93 (1985).
- Fabre, J., Lim, S. H., Morris, P. J. Renal transplantation in the rat: details of a technique. The Austalian and New Zealand Journal of Surgery. 41 (1), 69-75 (1971).
- Cameron, A. M., et al. Chimeric Allografts Induced by Short-Term Treatment With Stem Cell Mobilizing Agents Result in Long-Term Kidney Transplant Survival Without Immunosuppression: II, Study in Miniature Swine. American Journal of Transplantation. 16 (7), 2066-2076 (2016).
